王素（杭州口腔醫(yī)院，浙江杭州310006）

PDGF在實(shí)驗(yàn)性牙周改建過程中的表達(dá)變化

王素
（杭州口腔醫(yī)院，浙江杭州310006）

目的探討PDGF-AA在實(shí)驗(yàn)性牙周組織改建過程中的表達(dá)變化。方法建立大鼠試驗(yàn)性正畸牙移動(dòng)的動(dòng)物模型，隨機(jī)選擇一側(cè)加力作為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)不加力作為對照組。測量正畸后牙齒的移動(dòng)距離，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記PDGF-AA，對各組表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果PDGF-AA表達(dá)于正常牙周組織中。在實(shí)驗(yàn)性正畸牙齒移動(dòng)過程中：（1）正畸牙移動(dòng)的距離和PDGF-AA在牙周組織內(nèi)的表達(dá)及分布隨加力時(shí)間的增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（2）實(shí)驗(yàn)組PDGF-AA的色度值高于對照組（P＜0.05）；受壓側(cè)色度值顯著低于牽張側(cè)（P＜0.05）；（3）PDGF-AA表達(dá)的變化與牙移動(dòng)的距離之間無顯著的相關(guān)性 （r＜0.5）。結(jié)論正常牙周組織表達(dá)PDGF-AA，且PDGF-AA參與正畸牙移動(dòng)的骨改建過程，且在骨形成的牽張側(cè)表達(dá)高于骨吸收的受壓側(cè)。

血小板衍生生長因子；牙周改建；免疫組織化學(xué)染色；牙移動(dòng)

牙周組織在人的一生中不斷改建，近年研究表明，正畸過程中牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblast，PDLF）首先接受正畸力產(chǎn)生骨改建，導(dǎo)致牙移動(dòng)［1］。PDLF向牙槽骨表面遷移并分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞不斷地形成新的牙槽骨和牙骨質(zhì)，發(fā)生骨改建［2-4］。骨改建與很多細(xì)胞因子有關(guān)，包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）［5］。PDGF參與骨細(xì)胞增殖、發(fā)化以及基質(zhì)的含成，其中PDGF-AA可由正常人體骨細(xì)胞表達(dá)，骨組織中含量豐富，是一種骨代謝調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)借助正畸牙移動(dòng)的牙周改建模型，探討PDGF-AA在牙周中的表達(dá)及初步研究隨加力、時(shí)間的變化，PDGF的表達(dá)及其在牙周改建中的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取Wistar大鼠18只（湖北省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌性，體質(zhì)量220～250g。（2）實(shí)驗(yàn)材料及儀器：0.2mm正畸不銹鋼結(jié)扎絲（上海埃蒙迪材料科技）；鎳鈦螺旋彈簧（上海埃蒙迪材料科技）；測力計(jì)。（3）主要試劑：山羊抗大鼠PDGF-AA多克隆抗體（Santa Cruz Company）；SP免疫組化試劑盒 （北京中杉生物技術(shù)有限公司）。（4）主要儀器：光學(xué)顯微鏡（Olympus BHS-313，Japan）；體式數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)（Zeiss，Germany）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立將18只大鼠隨機(jī)分成3天組、7天組和14天組，每組6只。通過自身左右對照，隨機(jī)選定一側(cè)上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)上頜第一磨牙為對照組。對大鼠進(jìn)行麻醉，使用牙科高速渦輪車針在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上頜切牙唇側(cè)、腭側(cè)和實(shí)驗(yàn)側(cè)第一磨牙近中軸面角處分別作一個(gè)深0.3～0.5mm的固位溝（圖1），實(shí)驗(yàn)組用0.2mm正畸不銹鋼結(jié)扎絲將鎳鈦螺旋彈簧結(jié)扎在上頜切牙和第一磨牙間，測力使螺旋彈簧均產(chǎn)生力值約50g的拉力，牽引上頜第一磨牙向近中移動(dòng)（圖2）。第一磨牙正畸移動(dòng)過程中，近中為受壓側(cè)，遠(yuǎn)中為牽張側(cè)。對照組不做以上牽引。

1.2.2標(biāo)本的獲取正畸手術(shù)后3、7、14天時(shí)將動(dòng)物處死。取含兩側(cè)上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，常規(guī)固定，4℃下10%EDTA脫鈣6～9周，60%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。制備5μm連續(xù)切片。對同一只大鼠的實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)同時(shí)進(jìn)行免疫組化定位。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1正畸后牙移動(dòng)距離的測量使用體式數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)（Zeiss，Germany）對正畸后兩側(cè)上頜牙進(jìn)行拍照，在攝影過程中保持各組上頜第一磨牙的牙合面垂直于攝影球管的中心線，以保證測量結(jié)果的一致性。使用WCIF Image J分析軟件測量牙移動(dòng)的距離。

1.3.2免疫組化的半定量分析利用色度值進(jìn)行半定量分析。在組織切片上確定2個(gè)測量部位：第一磨牙根中1/3處近中（受壓側(cè)）、遠(yuǎn)中（牽張側(cè)）側(cè)。制定色度分級評分標(biāo)準(zhǔn)（圖3～5，0分與2分之間為1分，2分與4分之間為3分）。統(tǒng)一培訓(xùn)后兩人分別獨(dú)立打分后取平均值，檢測各組標(biāo)本平均色度值。以PBS代替一抗的空白對照作為陰性對照。

圖1　制作固位溝

圖2　正畸牽引上頜第一磨牙向近中移動(dòng)

圖3　PDGF-AA-R色度值為0分

圖4　PDGF-AA-R色度值為2分

圖5　PDGF-AA-R色度值為4分

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0 for windows軟件，實(shí)驗(yàn)組和對照組采用自身配對t檢驗(yàn)，各組間進(jìn)行方差分析，將牙移動(dòng)的距離和PDGF-AA-R表達(dá)的色度值進(jìn)行相關(guān)性分析。

表1　不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組和對照組、受壓側(cè)和牽張側(cè)正畸牙移動(dòng)距離與色度值的關(guān)系

2　結(jié)果

2.1移動(dòng)距離與色度值在1030像素下實(shí)驗(yàn)組移動(dòng)距離在3天、7天和14天之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在各時(shí)間點(diǎn)，色度值實(shí)驗(yàn)組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），受壓側(cè)色度值顯著低于牽張側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PDGFAA表達(dá)的變化與牙移動(dòng)的距離之間無顯著相關(guān)性（r＜0.5）。

2.2免疫組化免疫組化染色結(jié)果證實(shí)，PDGF-AA存在于正常大鼠的牙周組織中（下圖均為第一磨牙的牙周和骨組織）（圖6），且主要表達(dá)于牙齦細(xì)胞及牙周組織的牙周膜成纖維細(xì)胞和牙槽骨表面的成骨細(xì)胞胞膜和胞漿中，呈陽性表達(dá)。陰性對照、對照組及實(shí)驗(yàn)組的PDGF-AA表達(dá)情況詳見圖7～9。

圖6　PDGF-AA在正常牙周組織中的表達(dá)（×100）

圖7　陰性對照（以PBS代替一抗）（×100）

圖8　對照組（弱陽性表達(dá)）（×100）

圖9　實(shí)驗(yàn)組（強(qiáng)陽性表達(dá)）（×100）

3　討論

正畸牙齒移動(dòng)的過程實(shí)質(zhì)是牙周組織進(jìn)行不斷改建的過程，而牙周組織的改建最終主要表現(xiàn)為牙槽骨的改建。牙周組織的改建過程十分復(fù)雜，是一個(gè)多因素的調(diào)控體系網(wǎng)。在眾多的影響因素中，生長因子的局部調(diào)控發(fā)揮著重要作用［6］，因此研究骨生長因子的改變對進(jìn)一步闡明骨改建發(fā)生機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義。血小板衍生生長因子是骨改建的一種調(diào)控因子，主要促進(jìn)骨細(xì)胞的合成和細(xì)胞復(fù)制，加速骨質(zhì)形成。實(shí)驗(yàn)研究證明，血小板衍生因子能夠促進(jìn)骨細(xì)胞的分裂、增殖，調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的功能，對骨形成有一定的促進(jìn)作用［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)中，對牙槽骨進(jìn)行改建，PDGF-AA的表達(dá)在加力的實(shí)驗(yàn)組顯著高于未加力的對照組，推測在PDGF-AA很可能參與牙槽骨的改建；并且還發(fā)現(xiàn)，PDGF-AA的表達(dá)在骨形成的牽張側(cè)高于骨吸收的受壓側(cè)，推測PDGF-AA參與了骨的形成和吸收，并且可能在牙移動(dòng)的過程中，介導(dǎo)骨形成的作用強(qiáng)于骨吸收。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3天、7天和14天組，隨時(shí)間的增加，牙移動(dòng)的距離和PDGF-AA的表達(dá)都未出現(xiàn)顯著的增加。分析其原因：（1）實(shí)驗(yàn)使用的正畸力（50g）過大，導(dǎo)致骨改建過快，PDGF-AA的表達(dá)很快達(dá)到一個(gè)高峰值，導(dǎo)致差異不明顯；（2）本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間段設(shè)定較少；（3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量不夠大，導(dǎo)致差異的偏差。

本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于發(fā)現(xiàn)在牙周組織中有PDGF-AA的表達(dá)，并對其在牙周骨改建中的作用進(jìn)行了初步的探索研究，對進(jìn)一步促進(jìn)正畸牙移動(dòng)骨改建、牙周組織修復(fù)與再生以及種植體周圍牙周骨整合的形成具有重要意義。

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·臨床研究·