張霖，樊亞超，李曉姝，廖莎，王鵬翔，喬凱（中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，遼寧 撫順113001）

研究開發(fā)

兩種堿性pH調(diào)節(jié)劑對(duì)1，3-丙二醇發(fā)酵過(guò)程的影響

張霖，樊亞超，李曉姝，廖莎，王鵬翔，喬凱
（中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，遼寧 撫順113001）

氫氧化鈉、氫氧化鈣作為堿性pH調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵行業(yè)。兩種pH調(diào)節(jié)劑在發(fā)酵過(guò)程中形成的有機(jī)酸鹽，其溶解性存在顯著差異，從而間接影響發(fā)酵過(guò)程。本文重點(diǎn)考察了兩種堿性pH調(diào)節(jié)劑對(duì)1，3-丙二醇發(fā)酵過(guò)程的影響，通過(guò)發(fā)酵液滲透壓、尾氣組成、發(fā)酵周期、生產(chǎn)強(qiáng)度等過(guò)程參數(shù)的試驗(yàn)考察，分析了可溶性強(qiáng)堿作為pH調(diào)節(jié)劑不利于1，3-丙二醇發(fā)酵的原因，并且在以氫氧化鈉作為pH調(diào)節(jié)劑的發(fā)酵體系中，考察了區(qū)間厭氧發(fā)酵方案的可行性。從氫氧化鈉pH調(diào)控下的發(fā)酵周期來(lái)看，約21h后轉(zhuǎn)入發(fā)酵末期，發(fā)酵活躍期相對(duì)較短，因此縮短發(fā)酵周期，有利于提高平均生產(chǎn)強(qiáng)度。另外，通過(guò)區(qū)間厭氧通氣方案，能夠進(jìn)一步減少氮?dú)馐褂昧?，提高該工藝的?jīng)濟(jì)性。

1，3-丙二醇；pH調(diào)節(jié)劑；發(fā)酵；厭氧

1，3-丙二醇（1，3-propanediol，PDO）主要用于生產(chǎn)性能優(yōu)異的新型聚酯——聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯（polytrimethylene terephthalate，PTT）［1-2］。1，3-PDO工業(yè)生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物法兩大類［3］，生物轉(zhuǎn)化法具有條件溫和、操作簡(jiǎn)便、選擇性好、節(jié)省能源、設(shè)備投資少和環(huán)境良好等優(yōu)點(diǎn)，是一種生產(chǎn)成本低、污染少的方法［4-5］。

以甘油為底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化法制備1，3-PDO過(guò)程中，副反應(yīng)較多，產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物有機(jī)酸［6］。胡秋龍［7］、徐衛(wèi)濤［8］、PETROV［9］等研究了pH對(duì)克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn) 1，3-PDO的影響與控制，證明了pH控制對(duì)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的生成有著重要影響。修志龍［10］設(shè)計(jì)了3種pH調(diào)控方式，考察了鈉離子、鉀離子和銨離子對(duì)甘油連續(xù)生物歧化過(guò)程的影響。目前氫氧化鈉、氫氧化鈣、氨水等堿性pH調(diào)節(jié)劑被大量應(yīng)用于1，3-PDO發(fā)酵過(guò)程。研究表明，單純以1，3-PDO產(chǎn)物濃度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，相同實(shí)驗(yàn)條件下，氫氧化鈣作為pH調(diào)節(jié)劑的實(shí)驗(yàn)效果明顯優(yōu)于氫氧化鈉，但是氫氧化鈣作為pH調(diào)節(jié)劑使用，在發(fā)酵后期以及產(chǎn)品提取過(guò)程中，必然會(huì)形成大量的鈣鹽形式固體廢物，固體廢物的處理提高了該工藝的生產(chǎn)成本，從而降低了經(jīng)濟(jì)性，影響其工業(yè)應(yīng)用。相對(duì)而言，以氫氧化鈉作為pH調(diào)節(jié)劑，發(fā)酵工藝實(shí)施過(guò)程中形成的固體廢物很少，因此該工藝更具應(yīng)用前景。

本文通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)分析了氫氧化鈣、氫氧化鈉兩種pH調(diào)節(jié)劑對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，在此基礎(chǔ)上，為提高氫氧化鈉pH調(diào)節(jié)模式應(yīng)用效果，針對(duì)其發(fā)酵特征，設(shè)計(jì)并考察了氫氧化鈉pH調(diào)節(jié)模式下的區(qū)間厭氧發(fā)酵方案的可行性。

1　材料與方法

1.1菌種

本實(shí)驗(yàn)中所用的菌種為肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsieblla pneumoniae），來(lái)自中國(guó)石化撫順石油化工研究院專利菌種，菌種在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）保藏，保藏號(hào)為0798。

1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：甘油20g/L，NH4Cl 4.28g/L，KCl 0.6g/L，NaH2PO4·H2O 1.1g/L，Na2SO40.23g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，檸檬酸0.34g/L，酵母膏1g/L，Vc 0.1g/L。pH=7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油 40g/L，NH4Cl 5.35g/L，KCl 0.75g/L，NaH2PO4·H2O 1.38g/L，Na2SO40.28g/L， MgCl2·6H2O 0.26g/L， CaCl2·H2O 0.0029g/L，檸檬酸 0.42g/L，酵母膏 1.2g/L，Vc 0.1g/L。pH=7.0。

1.3菌種培養(yǎng)

采用1L種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。接種量為1%。培養(yǎng)控制條件：溫度為37℃，攪拌速度為400r/min，以5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，使其控制為7.0，培養(yǎng)周期16h。

1.4發(fā)酵方法

發(fā)酵罐體積選擇 2.5L、15L，采用批次發(fā)酵模式。接種量為10%。發(fā)酵控制條件：溫度為37℃，攪拌速度為400r/min，以5mol/L NaOH或5mol/L Ca（OH）2進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，使其控制為7.0，發(fā)酵周期30～48h。過(guò)程中定時(shí)取發(fā)酵液進(jìn)行液相分析，并根據(jù)分析結(jié)果補(bǔ)加甘油，使甘油濃度維持在 15～25g/L。

1.5分析方法

（1）液相分析以 Waters 2695分離系統(tǒng)與Waters 2414示差檢測(cè)器構(gòu)成液相分析系統(tǒng)，其中分離柱選用Aminex HPX-87H，用于分析反應(yīng)體系中底物甘油的消耗情況、產(chǎn)物1，3-PDO以及主要副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸等的積累情況。流動(dòng)相為0.005mol/L硫酸溶液，流速0.5mL/min，柱溫40℃。

（2）氣相分析安捷倫7890型氣相色譜，采用熱導(dǎo)檢測(cè)器，用于氣體組成分析。載氣為高純氦氣，柱溫50℃，進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度分別為150℃、200℃。

（3）生物量測(cè)定采用細(xì)胞干重方法，將4mL的發(fā)酵液加入烘干至恒重的 5mL離心管中，3000r/min離心 30min，棄去上清液，敞口放置于80℃烘箱中，烘干至恒重，增量就是細(xì)胞的干重，每個(gè)濃度取3次平行，最后計(jì)算平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1兩種pH調(diào)控模式下通氣單因素試驗(yàn)考察

試驗(yàn)中設(shè)置微氧、厭氧兩種發(fā)酵模式，分別考察氫氧化鈣、氫氧化鈉作為pH調(diào)節(jié)劑的兩種發(fā)酵模式，在發(fā)酵周期內(nèi)各種通氣方案對(duì)1，3-PDO發(fā)酵水平的影響。其中厭氧發(fā)酵模式采用通入氮?dú)獾男问?，通氣量分別為0.1vvm、0.2vvm、0.4vvm、0.6vvm （vvm為每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值）。

氫氧化鈣pH調(diào)控模式下通氣單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

僅以1，3-PDO最終產(chǎn)量來(lái)看，氫氧化鈣作為pH調(diào)節(jié)劑的發(fā)酵模式，通入氮?dú)獾膮捬醢l(fā)酵結(jié)果要明顯好于微氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵1，3-PDO發(fā)酵平均濃度應(yīng)大于70g/L；從試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，增加氮?dú)馔饬?，其發(fā)酵水平略有提高，比較0.2vvm和0.4vvm兩種通氣形式，氮?dú)馔饬刻岣咭槐叮?，3-PDO的產(chǎn)量提高10.3%。

表1　氫氧化鈣pH調(diào)控模式下通氣量對(duì)1，3-PDO發(fā)酵水平的影響

氫氧化鈉pH調(diào)控模式下通氣單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　氫氧化鈉pH調(diào)控模式下通氣量對(duì)1，3-PDO發(fā)酵水平的影響

以1，3-PDO最終產(chǎn)量來(lái)看，氫氧化鈉作為pH調(diào)節(jié)劑的發(fā)酵模式，通入氮?dú)獾膮捬醢l(fā)酵結(jié)果要明顯好于微氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵1，3-PDO發(fā)酵平均濃度應(yīng)大于50g/L；從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，增加氮?dú)馔饬?，?duì)其發(fā)酵水平影響不大，0.1～0.6vvm通氣量條件下，1，3-PDO產(chǎn)量保持在50～55g/L水平。

兩種pH調(diào)控模式對(duì)發(fā)酵周期、生產(chǎn)強(qiáng)度的影響結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　兩種pH調(diào)節(jié)下PDO產(chǎn)出情況

圖2　氫氧化鈉pH調(diào)控模式下通氣對(duì)發(fā)酵周期的影響

從發(fā)酵全周期來(lái)看，分為發(fā)酵活躍期和發(fā)酵末期兩個(gè)階段，在氫氧化鈣pH調(diào)控體系下，發(fā)酵活躍期和發(fā)酵末期以30h為分界點(diǎn)，此時(shí)的1，3-PDO產(chǎn)量即可達(dá)到最終產(chǎn)量的92%。

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，厭氧發(fā)酵模式的發(fā)酵活躍期維持時(shí)間要明顯長(zhǎng)于微氧發(fā)酵模式，氫氧化鈣pH調(diào)控模式下的發(fā)酵活躍期維持時(shí)間要明顯長(zhǎng)于氫氧化鈉pH調(diào)控模式。

從氮?dú)馔饬拷嵌葋?lái)看，0.2～0.4vvm的通氣量變化對(duì)發(fā)酵活躍期的影響并不明顯。

從氫氧化鈉pH調(diào)控下的發(fā)酵周期來(lái)看，發(fā)酵活躍期和發(fā)酵末期的分界時(shí)間點(diǎn)為21h左右，發(fā)酵活躍期相對(duì)較短；在該調(diào)控體系下，厭氧發(fā)酵模式的1，3-PDO產(chǎn)量具有明顯優(yōu)勢(shì)，但氮?dú)馔饬康脑黾?，?duì)其發(fā)酵水平并未產(chǎn)生同比增長(zhǎng)。

2.2兩種pH調(diào)控模式下發(fā)酵液鹽濃度考察

按照1.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件考察試驗(yàn)發(fā)酵周期內(nèi)發(fā)酵液電導(dǎo)率變化情況，以溶液電導(dǎo)率表征溶液鹽離子濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，發(fā)酵體系中鹽離子濃度呈增加的趨勢(shì)；結(jié)合對(duì)應(yīng)批次副產(chǎn)物有機(jī)酸的產(chǎn)出情況發(fā)現(xiàn)，9～18h是副產(chǎn)物有機(jī)酸及1，3-PDO生產(chǎn)強(qiáng)度最大的時(shí)間段，因此可以對(duì)溶液鹽濃度增加的現(xiàn)象進(jìn)行合理的解釋；相比較而言，氫氧化鈉pH調(diào)控模式下，其鹽離子濃度增加的更加明顯，其濃度增加 44.11%遠(yuǎn)高于氫氧化鈣pH調(diào)控模式下的17.82%，主要原因在于鈣鹽的溶解性要明顯低于對(duì)應(yīng)的鈉鹽；試驗(yàn)結(jié)果從滲透壓影響菌體生長(zhǎng)角度，能夠解釋氫氧化鈣pH調(diào)控模式在1，3-PDD發(fā)酵水平上具有優(yōu)勢(shì)的原因。

表3　發(fā)酵周期內(nèi)發(fā)酵液電導(dǎo)率變化情況

2.3兩種pH調(diào)控模式下的尾氣分析

針對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩種pH調(diào)控模式下的尾氣進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4及表5。

表4　氫氧化鈉pH調(diào)控模式第10批次發(fā)酵尾氣分析

表5　氫氧化鈣pH調(diào)控模式第4批次發(fā)酵尾氣分析

從尾氣中CO2含量分析來(lái)看，氫氧化鈣pH調(diào)控模式下4～16h內(nèi)CO2含量要明顯高于同期氫氧化鈉pH調(diào)控模式下的CO2含量。一方面，氫氧化鈣較氫氧化鈉更易于吸收CO2形成沉淀，降低CO2含量；另一方面，CO2主要來(lái)源于菌體代謝中的脫羧反應(yīng)，菌體活性越強(qiáng)其反應(yīng)越強(qiáng)烈。綜合來(lái)看，該試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了氫氧化鈣pH調(diào)控利于延長(zhǎng)發(fā)酵活躍期，從而提高1，3-PDO產(chǎn)量。

2.4氫氧化鈉pH調(diào)控模式下區(qū)間厭氧發(fā)酵試驗(yàn)

結(jié)合試驗(yàn)菌種生長(zhǎng)曲線，將發(fā)酵周期分為延滯期（0～4h）、菌體生長(zhǎng)期（4～8h）、發(fā)酵活躍期（8～22h）、發(fā)酵末期（22～36h）。在氫氧化鈉pH調(diào)控體系下，通過(guò)在不同階段厭氧控制，考察區(qū)間厭氧方式對(duì)發(fā)酵水平的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　氫氧化鈉pH調(diào)控模式下區(qū)間厭氧發(fā)酵情況

從區(qū)間厭氧發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，延滯期、菌體生長(zhǎng)期的厭氧通氣控制，對(duì)提升發(fā)酵水平的作用不大，而發(fā)酵活躍期保持厭氧通氣控制，能夠明顯提升發(fā)酵水平。

區(qū)間厭氧發(fā)酵過(guò)程中，副產(chǎn)乙酸、琥珀酸的情況見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　區(qū)間厭氧發(fā)酵中副產(chǎn)乙酸濃度隨時(shí)間的變化

圖4　區(qū)間厭氧發(fā)酵中副產(chǎn)琥珀酸濃度隨時(shí)間的變化

從圖3、圖4中可以看出，發(fā)酵活躍期進(jìn)行厭氧通氣控制，其副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸的產(chǎn)量明顯增加。由于乙酸代謝有利于1，3-PDO的生成，因此證明了發(fā)酵活躍期厭氧控制有利于提高發(fā)酵水平。雖然在氫氧化鈉pH調(diào)控模式下，副產(chǎn)物有機(jī)酸濃度增加，會(huì)增加發(fā)酵液中離子濃度，影響發(fā)酵體系滲透壓，但是由于厭氧通氣所使用的氮?dú)猓軌驍y帶出CO2氣體，降低了溶液酸性，因此綜合分析，發(fā)酵活躍期的區(qū)間厭氧通氣方案，能夠進(jìn)一步提升發(fā)酵水平。

3　結(jié)　論

（1）從提高 1，3-PDO發(fā)酵水平角度來(lái)看，氫氧化鈣pH調(diào)控模式要優(yōu)于氫氧化鈉pH調(diào)控模式，通過(guò)尾氣、溶液離子濃度、發(fā)酵周期、生產(chǎn)強(qiáng)度等過(guò)程參數(shù)分析對(duì)上述現(xiàn)象能夠進(jìn)行合理解釋。

（2）從氫氧化鈉pH調(diào)控下的發(fā)酵周期來(lái)看，其發(fā)酵活躍期和發(fā)酵末期的分界時(shí)間點(diǎn)為 21h左右，發(fā)酵活躍期相對(duì)較短，因此縮短發(fā)酵周期，提高平均生產(chǎn)強(qiáng)度，有利于該調(diào)控方案的工業(yè)化應(yīng)用。

（3）與微氧相比，厭氧發(fā)酵模式有助于提高發(fā)酵水平，其中氮?dú)馔饬恳?0.4vvm為限，單純?cè)黾油饬课幢孬@得等比效果。

（4）在氫氧化鈉pH調(diào)控模式下，可以將發(fā)酵周期分為延滯期、菌體生長(zhǎng)期、發(fā)酵活躍期、發(fā)酵末期，通過(guò)區(qū)間厭氧通氣方案的設(shè)計(jì)，在提高發(fā)酵水平的前提下，進(jìn)一步減少氮?dú)馐褂昧?，能夠提高該工藝方案的?jīng)濟(jì)性。

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Effects of two alkaline pH regulators on the fermentation of 1，3-propanediol

ZHANG Lin，F(xiàn)AN Yachao，LI Xiaoshu，LIAO Sha，WANG Pengxiang，QIAO Kai
（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，F(xiàn)RIPP，SINOPEC，F(xiàn)ushun 113001，Liaoning，China）

As alkaline pH regulators，sodium hydroxide and calcium hydroxide are widely applied in fermentation industry. In the fermentation process，these two pH regulators produce organic acid salts with significantly different solubility，which can indirectly affect the fermentation process. This study focused on investigating the effects of two alkaline pH regulators on the 1，3-propanediol fermentation process. Through laboratory investigations on the process parameters （including osmotic pressure of the fermentation liquor，composition of tail gas，fermentation period and production intensity），the negative effect of using soluble strong alkali as pH regulator in 1，3-propanediol fermentation has been analyzed. The feasibility of interval anaerobic fermentation has also been examined using sodium hydroxide as pH regulator，and the fermentation grows into its end stage after about 21 hours within one period. So，the active stage of fermentation is relatively short，and shortening the fermentation period should be helpful to raise the production intensity. In addition，by ventilation during the interval anaerobic fermentation，the use of nitrogen can be further reduced to improve the economical efficiency of this process.

1，3-propanediol；pH regulator；fermentation；anaerobic

TQ 923

A

1000-6613（2016）08-2542-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.08.38

2016-04-08；修改稿日期：2016-05-11。

及聯(lián)系人：張霖（1981—），男，碩士研究生，工程師。E-mail zhl.fshy@sinopec.com。