鄧 越 劉海東 莊 樂 馬偉元

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·論著·

真核細(xì)胞翻譯起始因子4E在皮膚基底細(xì)胞癌中的表達(dá)

鄧 越 劉海東 莊 樂 馬偉元

目的： 檢測皮膚基底細(xì)胞癌中真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）的表達(dá)。方法： 采用免疫組化PV-9000法和Real-time PCR法分別檢測20例皮膚基底細(xì)胞癌及20名健康皮膚組織中eIF4E蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果： 基底細(xì)胞癌和健康皮膚組織中eIF4E蛋白MOD值分別為（0.198± 0.031）和（0.096±0.015），mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（2.32±1.00）和（1.24±0.17），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論： eIF4E可能參與皮膚腫瘤的發(fā)病過程。

基底細(xì)胞癌； 真核細(xì)胞翻譯起始因子4E； 免疫組化； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 收集2014年1月至2015年1月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科病理室診斷的BCC蠟塊標(biāo)

本20例。其中男女各半，年齡59～74歲，中位年齡68歲，病史1個(gè)月～12年。發(fā)病部位均為顏面部，其中眼周4例，鼻翼5例，鼻唇溝4例，面頰5例，顳部2例。病理分型：結(jié)節(jié)潰瘍型9例，色素型5例，淺表型3例，硬皮病樣型1例，腺樣型2例。另取皮膚外科術(shù)中廢棄的健康皮膚標(biāo)本20例作為對(duì)照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。

1.1.2主要試劑 濃縮型兔抗人eIF4E多克隆抗體（貨號(hào)：ab76256，規(guī)格：100 μL/支）購于美國Abcam生物工程有限公司，二步法免疫組化試劑盒（貨號(hào)：PV-9000，規(guī)格：5 mL/支）、DAB顯色液（貨號(hào)：ZLI-9019，規(guī)格：10 mL/瓶）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。離心柱型石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒（貨號(hào)：RP5321，規(guī)格：50次）、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（貨號(hào)：PR6502，規(guī)格：10000 U）、2×Super SYBR real-time PCR premixture（貨號(hào)：PR7031，規(guī)格：125次）購于北京百泰克生物技術(shù)公司，其它實(shí)驗(yàn)用品由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測eIF4E蛋白的表達(dá) 蠟塊3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，EDTA（PH=9.0）修復(fù)液高溫高壓修復(fù)3.5 min，4℃冷卻1 h。3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，山羊血清37℃封閉20 min。滴加兔抗人eIF4E多克隆抗體（工作濃度為1∶50），4℃孵育過夜。嚴(yán)格按照PV-9000試劑盒說明書中步驟滴加二抗。顯微鏡控制DAB顯色，自來水終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

結(jié)果判定：由兩位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)具有代表性的高倍鏡視野（40×）進(jìn)行拍照，曝光條件均一致，OLYMPUS-DP2-BSW全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行彩色圖像的采集與儲(chǔ)存。用image pro-plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出每張切片的平均光密度值MOD，MOD=sum（IOD）/sum（area）。MOD值越高，表達(dá)越強(qiáng)。

1.2.2Real-time PCR法檢測eIF4E mRNA的表達(dá)

①RNA提?。喊碦NA提取試劑盒說明書提取健康對(duì)照皮膚及基底細(xì)胞癌中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA含量和純度；②cDNA鏈合成：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為20 μL，包括經(jīng)檢測合格的RNA 0.5 μg、隨機(jī)引物200 μg、50 μM oligo（dT）1 μL、5×Reaction Buffer 4 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、RNase-free ddH2O 10 μL、Thermo M-MLV（200 U/μL）1 μL，反應(yīng)條件：25℃ 10 min，42℃50 min，反應(yīng)產(chǎn)物-80℃保存?zhèn)溆?；③熒光?shí)時(shí)定量PCR：引物由上海生工生物工程有限公司合成，內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物226 bp；eIF4E mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物246 bp（表1）。

表1　eIF4E、GAPDH擴(kuò)增引物序列表

實(shí)時(shí)定量PCR：使用定量PCR反應(yīng)儀檢測，采用20 μL反應(yīng)體系。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃起始模板變性2 min（1循環(huán)），95℃模板變性15 s，65℃退火、延伸40 s收集熒光信號(hào)（40循環(huán)），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，得到每個(gè)標(biāo)本不同指標(biāo)的Ct值，以GAPDH mRNA的量為內(nèi)參照，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算出所測指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量（表2）。

表2　定量PCR反應(yīng)儀所測指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量

2　結(jié)果

2.1eIF4E蛋白的表達(dá) eIF4E在健康對(duì)照皮膚的表皮中未見表達(dá)（圖1a），其MOD值為（0.096±0.015）；基底細(xì)胞癌腫瘤團(tuán)塊陽性表達(dá)率為95%（19/20），eIF4E主要定位于細(xì)胞漿中，部分細(xì)胞核中亦有表達(dá)，呈彌散性或散在性分布的棕黃色顆粒（圖1b），MOD值為（0.198±0.031）。由此可見，基底細(xì)胞癌中eIF4E蛋白的表達(dá)較健康皮膚明顯上調(diào)，差異具有顯著性意義（t=-13.497，P＜0.05）。

圖1　a：eIF4E蛋白在健康皮膚表達(dá)陰性；b：基底細(xì)胞癌皮損中表達(dá)陽性（PV-9000，×400）

2.2eIF4E mRNA的表達(dá) eIF4E mRNA在基底細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)（2.32±1.00），在健康皮膚組中呈現(xiàn)低表達(dá)（1.24±0.17），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（t=-4.807，P＜0.05）。

3　討論

eIF4E在多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)，過表達(dá)eIF4E通過選擇性地增加某些增殖相關(guān)基因和促生存基因（如c-myc、cyclinD1、ODC、VEGF、FGF2）的mR-NA翻譯來促使細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變［9］。目前研究主要發(fā)現(xiàn)兩種作用機(jī)制：①eIF4E因子可特異性的與真核細(xì)胞mRNA的5'末端帽結(jié)構(gòu)結(jié)合，參與mRNAs向核糖體的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；②eIF4E可顯著增加eIF4A解旋酶的活性［10］，eIF4E和eIF4A因子可協(xié)同解開mRNA 5' UTRs二級(jí)結(jié)構(gòu)［11］，從而啟動(dòng)特定mRNA的翻譯，顯著改變細(xì)胞的表型，促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化腫瘤形成和轉(zhuǎn)移［12］。但有關(guān)皮膚腫瘤，特別是基底細(xì)胞癌中eIF4E的表達(dá)情況，迄今尚未見國內(nèi)外報(bào)道。

本研究表明，eIF4E蛋白和mRNA在BCC組織中呈高表達(dá)，由此推測其可能參與BCC的發(fā)病過程。大量研究認(rèn)為引起B(yǎng)CC發(fā)病的最主要誘因是日光中UV導(dǎo)致的 DNA分子破壞從而觸發(fā) p53凋亡通路［13］，而Akt/mTOR通路拮抗p53的促凋亡作用，當(dāng)其調(diào)節(jié)失控時(shí)就會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)型和異常增殖［14］，因此BCC的發(fā)生與mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常密切有關(guān)。已有研究證實(shí)eIF4E能夠上調(diào)Akt蛋白的表達(dá)［13］，推測其可能作為mTOR信號(hào)通路的重要靶點(diǎn)。其次，eIF4E亦能調(diào)節(jié) VEGF、Cyclin D1因子的表達(dá)［17］，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的形成，促進(jìn)血管生成和腫瘤生長［15］。以上推測可能是 eIF4E在BCC發(fā)病過程中的作用機(jī)制，我們將在今后進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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（收稿：2015-12-07 修回：2015-12-30）

Expression of eIF4E in basal cell carcinoma

DENG Yue1，LIU Haidong2，ZHUANG Le2，MA Weiyuan2.
Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China Corresponding author：MA Weiyuan，E-mail：dermatologyqlh@163.com

Objective：To detect the expression of eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）in basal cell carcinoma（BCC）.Methods：The protein and mRNA expressions of eIF4E were detected by PV-9000 immunohistochemistry and real-time PCR in 20 patients with basal cell carcinoma and 20 healthy controls.Results：The MODs in BCC and controls were 0.198±0.031 and 0.096±0.015 respectively and the expression levels of mRNA were 2.32±1.00 and 1.24±0.17，with significant differences（P＜0.05）. Conclusion：eIF4E may involve in the pathogenesis of BCC.

basal cell carcinoma；eIF4E；immunohistochemistry；RT-PCR真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E）是一種25KD的多肽，是真核細(xì)胞翻譯起始和調(diào)控的核心部分，在蛋白質(zhì)的翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用［1］。研究表明eIF4E在多種實(shí)體腫瘤（例如乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌、子宮頸癌、白血病等）中高表達(dá)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)［2-6］?；准?xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC）占所有皮膚惡性腫瘤的70%［7］，雖發(fā)展較慢，很少發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（＜0.5%），但可引起嚴(yán)重的局部組織損壞［8］，加之其病因復(fù)雜，臨床及病理表現(xiàn)多樣，值得進(jìn)行深入而系統(tǒng)的研究。本研究對(duì)eIF4E蛋白和mRNA在皮膚基底細(xì)胞癌中的表達(dá)水平進(jìn)行研究，旨在初步探討其在BCC發(fā)病中的作用。

馬偉元，E-mail：dermatologyqlh@163.com

2014年山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2014HP007）

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南，250012