楊小燕，何志旭,2△，舒莉萍，金　皎，黃　璟，吳莎莎，馬健娟

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科　550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心　550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴陽 550004)

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Rap1基因在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)譜研究*

楊小燕1，何志旭1,2△，舒莉萍2,3，金皎1，黃璟1，吳莎莎1，馬健娟1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴陽 550004)

目的選擇斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究Rap1基因在胚胎早期發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。方法從斑馬魚胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段，將Rap1基因片段和pCS2+質(zhì)粒進(jìn)行體外連接重組，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、菌落聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及測(cè)序鑒定正確后，經(jīng)T3RNA體外轉(zhuǎn)錄體系合成DIG標(biāo)記的Rap1基因反義mRNA探針，采用整胚原位雜交方法檢測(cè)Rap1在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程的表達(dá)情況。結(jié)果在斑馬魚胚胎0.75 hpf的細(xì)胞分裂連接處、3.70 hpf和6.00 hpf的動(dòng)物極、12.00～72.00 hpf的脊索神經(jīng)部位均可見Rap1基因的陽性雜交信號(hào)。結(jié)論Rap1基因在斑馬魚脊索神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育過程中可能起到重要的調(diào)控作用。

Rap1基因；斑馬魚；原位雜交；基因表達(dá)

Rap1又稱Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白，是Kitayama在篩選NIH/3細(xì)胞中抑制Ras蛋白轉(zhuǎn)化功能的蛋白分子過程中發(fā)現(xiàn)的。Rap1的兩個(gè)亞型：Rap1a和Rap1b在氨基酸序列上具有超過90%的同源性，且與Ras蛋白有高度同源性。Rap1和其他G蛋白一樣，表現(xiàn)為無活性的GDP結(jié)合形式和有活性的GTP結(jié)合形式兩種構(gòu)象[1-2]。最初的研究認(rèn)為Rap1主要是通過直接與Ras的下游效應(yīng)子相互作用來干擾Ras信號(hào)通路，但最近更多的研究結(jié)果表明Rap1是一個(gè)功能獨(dú)立的信號(hào)通路,通過控制不同的信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘連、細(xì)胞間連接形成、細(xì)胞極性和細(xì)胞的增殖與分化[3-4]。目前，隨著研究的進(jìn)展，對(duì)Rap1基因的生物學(xué)功能有了較為深入的認(rèn)識(shí)，但Rap1基因在活體內(nèi)的表達(dá)情況報(bào)道較少，本研究選擇斑馬魚作為模式生物，通過克隆Rap1基因，采用全胚胎原位雜交技術(shù)(whole mount in situ hybridization，WISH)探求Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)情況,進(jìn)而為Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育早期功能的研究建立一定的基礎(chǔ)。

1　 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所選的野生型斑馬魚Tuebingen和pCS2+質(zhì)粒由上海生命科學(xué)院饋贈(zèng)。斑馬魚養(yǎng)殖根據(jù)Westerfield[5]描述的方法進(jìn)行,水溫28.5 ℃，交替給予照明14 h，黑暗10 h，定時(shí)喂以餌料。直至雌、雄斑馬魚生殖功能發(fā)育成熟后，將雌、雄斑馬魚按1∶1或1∶2進(jìn)行交配,次日清晨收集斑馬魚受精卵，斑馬魚胚胎的發(fā)育階段按文獻(xiàn)[5]描述的形態(tài)特征區(qū)分。為了方便觀察原位雜交結(jié)果，受精后超過24 h的胚胎給予0.003%苯硫脲(PTU) 處理防止黑色素形成,收集后的胚胎經(jīng)固定、脫水后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(北京諾賽生物有限公司)，質(zhì)粒小抽試劑盒(Axygen公司)，限制性內(nèi)切酶ClaI 和XbaI(Tiangen公司)，T3酶(Ambion公司),BCIP/NBT Alkaline phosphatase substrate kitⅣ(Vector Laboratories公司)， T4連接酶(FBI公司)，Trizol(Invitrogen公司)，DIG RNA Labeling mix 和Anti-digoxigenin AP-conjungate(Roche公司)，生物學(xué)顯微鏡(Nikon SMZ645)，雜交爐(美國(guó)UVP公司HL-2000),紫光分光光度儀(島津UV1700)，LRH系列生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

1.3克隆斑馬魚Rap1基因根據(jù)斑馬魚cDNA文庫中Rap1基因組序列，用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，正向引物序列：CCA TCG ATA TGC GTG AAT ACA AGT TAG；反向序列引物：GCT CTA GAT TTC ACC CGC AGA ATT TG,同時(shí)引入ClaI 、XbaI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。以收集0.75～72.00 hpf多個(gè)時(shí)相的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件為： 40 ℃ 30 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 8 min，94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物大小為321 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒的構(gòu)建pCS2+質(zhì)粒利用鈣轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入Ecoli DH5α感受態(tài)菌中，通過氨芐抗性篩選出陽性克隆，擴(kuò)增后運(yùn)用堿裂解法提取pCS2+質(zhì)粒DNA，用ClaI和XbaI雙酶切pCS2+質(zhì)粒，1%瓊脂糖電泳后割膠回收。將Rap1基因的PCR產(chǎn)物用ClaI和XbaI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，將上述割膠回收產(chǎn)物在T4酶的作用下相連接，將連接產(chǎn)物運(yùn)用鈣轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入Ecoli DH5α感受態(tài)菌中，經(jīng)氨芐抗性篩選出陽性克隆并擴(kuò)增后，運(yùn)用堿裂解法提取pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒。

1.5pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒的鑒定(1)雙酶切鑒定：用ClaI和XbaI雙酶切pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切產(chǎn)物大小；(2)菌落PCR鑒定：pCS2+-Rap1b重組質(zhì)粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大??；(3)序列測(cè)定鑒定：將重組質(zhì)粒送至北京賽諾生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定。

1.6地高辛標(biāo)記的Rap1基因反義mRNA的制備將pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒用ClaI進(jìn)行單酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒割膠回收得到線性化的pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒。利用T3體外轉(zhuǎn)錄體系，以線性化的pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒DNA為模板，以地高辛標(biāo)記的寡核苷酸為原料，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到地高辛標(biāo)記的Rap1反義mRNA探針后，用NucAwaylM Spin Columns純化吸附柱回收Rap1反義mRNA探針，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7斑馬魚全時(shí)相胚胎原位雜交(WISH)原位雜交按照Kyryachenko等[6]的方法進(jìn)行，收集Tuebingen野生型斑馬魚(0.75、3.70、6.00、12.00、18.00、24.00、36.00、48.00、72.00 hpf)9個(gè)時(shí)相點(diǎn)的胚胎各20枚，多聚甲醛固定胚胎，甲醛梯度脫水后-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒌?天在室溫下用1×PBST洗去多余甲醛溶液，將胚胎移入68 ℃雜交爐中預(yù)雜交1 h，然后加入Rap1基因反義mRNA探針后68 ℃雜交過夜。第2天洗去多余的探針后，加入anti-GIG-AP與Rap1基因反義mRNA探針結(jié)合過夜。第3天用1×PBST洗去未結(jié)合的抗體，再加入BCIP/NBT溶液顯色，在體視顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果后，用固定液對(duì)雜交胚胎進(jìn)行再固定并且照相。

2　結(jié)　　果

2.1Rap1基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果在圖1中于第2泳道位200～500 bp可見一特異性擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期321 bp相符；同時(shí)，第3泳道500 bp處可見一條帶，為內(nèi)參GAPDH的PCR產(chǎn)物，大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果將pCS2+- Rap1重組質(zhì)粒及pCS2+質(zhì)粒用ClaI和XbaI雙酶切，結(jié)果顯示：第2泳道為重組質(zhì)粒雙酶切后得到的Rap1基因片段，與PCR產(chǎn)物大小一致，而雙酶切后得到的載體DNA片段與第3泳道載體雙酶切片段大小一致，見圖2。

2.3pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果以重組質(zhì)粒菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，200～500 bp可見一特異性PCR片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符，見圖3。

1：DNA Marker Ⅲ；2：Rap1 PCR產(chǎn)物；3：GVPDH PCR產(chǎn)物；4：空白對(duì)照。

圖1Rap1基因RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1：DNA MarkerⅢ；2：pCS2+- Rap1重組質(zhì)粒；3：pCS2+；4：空白對(duì)照。

圖2pCS2+- Rap1重組質(zhì)粒與pCS2+載體質(zhì)粒ClaI和XbaI雙酶切結(jié)果

1：DNA Marker Ⅲ；2：Rap1 PCR產(chǎn)物；3：空白對(duì)照。

圖3pCS2+- Rap1重組質(zhì)粒菌液PCR結(jié)果

2.4pCS2+- Rap1重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果在Genbank中比對(duì)后顯示，測(cè)序結(jié)果與Rap1基因一致，見圖4。

2.5Rap1基因在野生型斑馬魚胚胎中的表達(dá)情況全胚胎原位雜交結(jié)果表明，在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎0.75～72.00 hpf發(fā)育過程中均可檢測(cè)到Rap1基因表達(dá)信號(hào)，但表達(dá)部位不同。Rap1在受精后0.75 hpf集中出現(xiàn)在細(xì)胞分裂連接處，3.70 hpf和6.00 hpf普遍性表達(dá)，斑馬魚體節(jié)形成期12.00 hpf開始特異性表達(dá)于胚胎脊索部位，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，30.00 hpf達(dá)高峰，之后Rap1在斑馬魚胚胎脊索部位表達(dá)信號(hào)逐漸減弱，一直持續(xù)至72.00 hpf，見圖5。

圖4pCS2+-Rap1重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

圖5　　Rap1基因在野生型斑馬魚早期發(fā)育過程中的表達(dá)情況

3　討　　論

斑馬魚作為一種新興的模式生物是研究基因功能的有效載體，全基因組測(cè)序已完成，其與哺乳動(dòng)物在分子途徑調(diào)控上高度保守。另外，與其他模式生物相比，斑馬魚是體外受精和發(fā)育，體積小，生殖周期短，生殖能力強(qiáng)，胚胎發(fā)育快且胚體透明，可以高效、連續(xù)和動(dòng)態(tài)觀察胚胎的發(fā)育[7-9]。WISH可以從整體水平反映胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空順序，常被廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育調(diào)控基因表達(dá)的研究[10]。通過對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行原位雜交，可以從三維、立體角度觀察Rap1基因在斑馬魚胚胎體內(nèi)的表達(dá)情況，這將為進(jìn)一步研究Rap1基因的分子調(diào)控機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

Rap1基因?qū)儆赗as超家族的小GTP結(jié)合蛋白之一。Rap1被激活之后，通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，參與一系列生物學(xué)活動(dòng)[11-12]。研究表明，Rap1調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附，影響細(xì)胞間黏附連接的定位和完整性[13-14]。Rap1GEFs，如PDZ-GEF和C3G，直接連在E-鈣黏蛋白或其他連接蛋白上，影響細(xì)胞的連接功能[15]；此外，Rap1 在細(xì)胞連接處累積，如Rap1 的效應(yīng)分子fadin/AF6 和某些調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的蛋白，都是連接蛋白[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rap1在胚胎細(xì)胞分裂連接處有Rap1表達(dá)信號(hào)，從體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了Rap1基因在細(xì)胞黏附連接形成位點(diǎn)局部可能發(fā)揮著重要作用。

細(xì)胞的極性是多數(shù)細(xì)胞的共同特征，是細(xì)胞分化和細(xì)胞行使正常功能的基礎(chǔ),細(xì)胞極性的建立對(duì)于生物體的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。研究顯示，Rap1參與了果蠅胚胎細(xì)胞極性的建立，并起到關(guān)鍵作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)Rap1基因在胚胎發(fā)育早期動(dòng)物極廣泛表達(dá)，可見Rap1基因?yàn)槟冈葱员磉_(dá)基因，其在胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。此外，從斑馬魚受精后12.00 hpf體節(jié)形成開始至72.00 hpf，在斑馬魚胚胎脊索均可見Rap1表達(dá)，表達(dá)信號(hào)隨著體節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育逐漸增強(qiáng)，于30.00 hpf達(dá)高峰，48.00 hpf表達(dá)信號(hào)減弱，持續(xù)至72.00 hpf。El-Kadi等[20]在爪蟾的研究中發(fā)現(xiàn)，Rap1在神經(jīng)板(背部外胚層)、神經(jīng)管等神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)。結(jié)合本研究結(jié)果，提示在脊椎動(dòng)物，Rap1在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)模式具有高度保守性，并且可能參與調(diào)控斑馬魚胚胎脊索神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育過程。

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Spatiotemporal expression spectrum of Rap1 gene in zebrafish early development process*

YangXiaoyan1,HeZhixu1,2△,ShuLiping2，3,JinJiao1,HuangJing1,WuSasa1,MaJianjuan1

(1.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;2.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,AffiliatedHospitalofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 3.TeachingandResearchingSectionofImmunology，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To choose zebrafish as the experimental animal model for studying the spatiotemporal expression rule of rap1 gen in zebrafish embryo early development process.MethodsThe Rap1 gene fragment was cloned from the zebrafish embyoscDNA,then the Rap1 gene fragment and pCS2+ plasmid were performed the in vitro connetion and recombination was extracted,the combinant plasmid was correct after the double enzyme digestion,colony PCR and sequencing identification.T3 RNA polymerase in vitro transcription system was used to obtain the digoxin(DIG)-labeled anti-sense mRNA probe of Rap1 gene.The whole mount in situ hybridization method was adopted to detect the Rap1 expression in zebrafish embryo early development process.ResultsThe positive hybridization signal of Rap1 gene was detected at the cell division junction region of 0.75 hpf,animal pole of 3.70 hpf and 6.00 hpf,and notochord of 12.00-72.00 hpf.ConclusionRap1 gene might be involved in the early development process of notochord nervous system in zebrafish.

Rap1 gene;zebrafish;in situ hybridization;gene expression

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30960412)；貴州省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目([2009]4005)；貴州省優(yōu)秀教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金($2008-4)。作者簡(jiǎn)介：楊小燕(1986-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事小兒血液系統(tǒng)方面的研究?！?/p>

,E-mail：hzxmedical@163.com。

Q132.4

A

1671-8348(2016)20-2748-04

2015-12-13

2016-02-28)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.004