陳　玲，于　楊，陳曼華

(武漢市中心醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430014)

?

哌唑嗪對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP-1和TIMP-1表達的影響*

陳玲，于楊，陳曼華△

(武漢市中心醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430014)

目的觀察哌唑嗪對ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達的影響，探討哌唑嗪的抗動脈粥樣硬化作用及其機制。方法將24只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為正常飲食組、高脂飲食組、哌唑嗪組，各8只，正常飲食組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組與哌唑嗪組均給予高脂飲食；于實驗第2周開始，哌唑嗪組在高脂飲食基礎(chǔ)上每日灌胃鹽酸哌唑嗪(1 mg/kg)，正常飲食組與高脂飲食組每日灌胃等體積生理鹽水。12周后，腹主靜脈取血檢測各組血脂水平，另取主動脈標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)法測定MMP-1與TIMP-1表達水平，并進行比較分析。結(jié)果與高脂飲食組比較，哌唑嗪組血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平均降低，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高脂飲食組小鼠主動脈內(nèi)膜粥樣斑塊面積和內(nèi)膜厚度均較正常飲食組明顯增加，而哌拉唑嗪明顯抑制斑塊形成和內(nèi)膜增生；與正常飲食組比較，高脂飲食組、哌唑嗪組MMP-1蛋白表達水平升高，TIMP-1蛋白表達水平降低，且哌唑嗪組MMP-1蛋白表達水平低于高脂飲食組，TIMP-1蛋白表達水平高于高脂飲食組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論哌唑嗪能夠降低TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，具有一定的抗動脈粥樣硬化作用，且其機制可能還與降低斑塊內(nèi)MMP-1表達水平，增加TIMP-1表達水平有關(guān)。

哌唑嗪；動脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶-1；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1

哌唑嗪為選擇性突觸后α1受體阻滯劑，能擴張周圍血管，使周圍血管阻力降低，起降壓作用，亦能擴張動脈和靜脈，降低心臟的前負(fù)荷與后負(fù)荷，還可用于治療心力衰竭，多項臨床觀察提示α1受體阻滯藥可能還具有改善脂質(zhì)代謝、抗動脈粥樣硬化的作用[1-2]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，α1 受體阻滯劑能降低血清總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平，并有抗動脈粥樣硬化的作用[3-4]。本研究通過觀察選擇性的α1受體阻滯劑哌唑嗪對ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1)表達的影響，探討哌唑嗪抗動脈粥樣硬化作用的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物8周齡雄性ApoE-/-小鼠(C57B/6J背景)24只購自北京華阜康公司，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心無特定病原體(SPF)級環(huán)境。

1.2儀器與試劑普通飼料和高脂飼料均由華中科技大學(xué)實驗動物中心加工制作。高脂飼料配方：82.3%基礎(chǔ)飼料、2.0%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5.0%白糖、10.0%豬油，普通飼料配方為小鼠生長繁殖期標(biāo)準(zhǔn)配方。鹽酸哌唑嗪片購自上海信誼藥廠有限公司，MMP-1和TIMP-1多克隆抗體購自武漢博士德公司；全自動生化分析儀購自日本Olympus公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(P0202)購自碧云天生物公司，Olympus BX51光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3方法

1.3.1分組與模型的建立24只小鼠隨機分為3組(各8只)：正常飲食組、高脂飲食組、哌唑嗪組。正常飲食組給予不含膽固醇的繁殖飼料(普通飼料)喂養(yǎng)，高脂飲食組與哌唑嗪組均給予高脂飲食。其中哌唑嗪組在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,于實驗第2周開始在高脂飲食基礎(chǔ)上每日定時以鹽酸哌唑嗪1 mg/kg灌胃(將鹽酸哌唑嗪片溶解于10 mL生理鹽水中)，正常飲食組與高脂飲食組每日灌胃等體積生理鹽水，共 12 周。

1.3.2處理方法所有小鼠于12周后禁食不禁水1夜，腹腔注射戊巴比妥(1 mg/kg)處死。取小鼠全血，靜止后取血清。小鼠麻醉后處死，分離主動脈瓣至髂腎動脈分支動脈組織，在相同部位取一段長約1 cm的主動脈，由4%多聚甲醛[含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)]固定。

1.3.3檢測指標(biāo)及方法各組TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)應(yīng)用生化分析儀進行檢測，所有操作步驟按儀器說明書進行。常規(guī)脫水，用石蠟包埋，每份標(biāo)本連續(xù)切片5 μm(40張)，每5張取1張，共取8張切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后在光鏡下觀察主動脈的形態(tài)學(xué)變化，用Image G多功能圖像分析軟件分析主動脈斑塊面積/血管內(nèi)膜表面積比值。染色檢測斑塊內(nèi)MMP-1和TIMP-1的表達。免疫組織化學(xué)：脫蠟、水化組織切片，3%過氧化氫(H2O2)去離子水孵育5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。滴加一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3次，每次2 min。滴加二抗羊抗兔IgG，室溫或37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次2 min，應(yīng)用DAB溶液顯色。蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片。每組隨機選取5張免疫組織化學(xué)切片，光鏡下觀察細(xì)胞上呈現(xiàn)棕色著色者判為陽性細(xì)胞，每張切片選擇陽性目標(biāo)最多的區(qū)域，采取3個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件進行吸光度分析。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)測定小鼠主動脈組織MMP-1和TIMP-1蛋白水平，操作步驟參照核蛋白提取試劑盒說明書及文獻[4]，從各組主動脈組織中取適量冷凍的血管組織剪碎、勻漿，提取核蛋白測定，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2　結(jié)　果

2.1哌唑嗪對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響飼養(yǎng)12周后，3組血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與正常飲食組比較，高脂飲食組血清TC、TG及LDL-C水平增高，HDL-C水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與高脂飲食組比較，哌唑嗪組血清TC、TG及LDL-C水平均降低，HDL-C水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1　3組ApoE-/-小鼠各項血脂指標(biāo)水平 比較

*：P<0.01，#：P<0.05，與正常飲食組比較；△：P<0.01，▲：P<0.05，與高脂飲食組比較。

2.23組小鼠主動脈形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下觀察，正常飲食組可見少量粥樣硬化斑塊；高脂飲食組內(nèi)膜出現(xiàn)明顯增厚，可見大量粥樣硬化斑塊；哌唑嗪組可見內(nèi)膜厚度較高脂飼料組明顯變薄，粥樣硬化斑塊較高脂飼料組明顯減少。見圖1。

2.33組主動脈斑塊面積/血管內(nèi)膜表面積比值比較ApoE-/-小鼠均見動脈粥樣斑塊形成，管腔呈不同程度的狹窄。與正常飲食組(0.162±0.023)比較，高脂飲食組小鼠主動脈斑塊面積/血管內(nèi)膜表面積比值(0.653±0.046)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而與高脂飲食組比較，哌唑嗪組小鼠主動脈斑塊面積/血管內(nèi)膜表面積比值(0.332±0.035)減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A:正常飲食組；B：高脂飲食組；C：哌唑嗪組。

圖13組小鼠主動脈內(nèi)膜HE染色(×40)

2.43組斑塊內(nèi)MMP-1及TIMP-1表達水平比較實驗結(jié)束后各組小鼠血管壁免疫組織化學(xué)染色顯示，呈棕黃色顆粒，MMP-1、TIMP-1均為陽性。與正常飲食組比較，高脂飲食組和哌唑嗪組MMP-1在小鼠斑塊及血管內(nèi)、中、外膜細(xì)胞染色陽性表達增加，哌唑嗪組與高脂飲食組比較，MMP-1陽性表達減少；與正常飲食組比較，TIMP-1在高脂飲食組和哌唑嗪組表達減少，哌唑嗪組與高脂飲食組比較，TIMP-1陽性表達增加。見圖2、3。與正常飲食組比較，高脂飲食組小鼠斑塊內(nèi)MMP-1平均吸光度值上升，斑塊內(nèi)TIMP-1平均吸光度值下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與高脂飲食組比較，哌唑嗪組斑塊內(nèi)MMP-1平均吸光度值下降，斑塊內(nèi)TIMP-1 平均吸光度值上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

A：正常飲食組；B：高脂飲食組；C：哌唑嗪組。

圖23組小鼠斑塊及周圍血管壁MPP-1的表達(光學(xué)顯微鏡，×400)

A：正常飲食組；B：高脂飲食組；C：哌唑嗪組。

圖3　3組小鼠斑塊及周圍血管壁TIMP-1的表達(光學(xué)顯微鏡，×400)表2　3組小鼠斑塊內(nèi)MMP-1及TIMP-1的吸光度值 比較

*：P<0.01，與正常飲食組比較；#：P<0.05，與高脂飲食組比較。

表3　3組小鼠主動脈組織MMP-1 和TIMP-1 蛋白表達

*：P<0.01，與正常飲食組比較；#：P<0.05，與高脂飲食組比較。

圖4　3組小鼠主動脈組織MMP-1和TIMP-1蛋白電泳圖

2.53組小鼠主動脈組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達水平比較Western blotting檢測結(jié)果顯示：與正常飲食組比較，高脂飲食組小鼠主動脈組織MMP-1蛋白表達水平上升，TIMP-1蛋白表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與高脂飲食組比較，哌唑嗪組主動脈組織MMP-1蛋白表達水平下降，TIMP-1蛋白表達水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖4。

3　討　論

多因素綜合作用造成動脈粥樣硬化的發(fā)生，有研究表明，炎性反應(yīng)與動脈粥樣硬化的關(guān)系比目前已知的其他任何因素更為密切[5]。ApoE-/-小鼠缺乏清除極低密度脂蛋白和乳糜微粒受體的配體，血液循環(huán)中脂類物質(zhì)容易累積，機體氧化和抗氧化平衡被破壞，易于誘導(dǎo)全身低程度炎性反應(yīng)，所以是目前研究動脈粥樣硬化的主要基因工程動物[6]。本實驗通過給予ApoE-/-小鼠高脂飲食，加劇誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，成功地誘導(dǎo)局部大面積動脈粥樣硬化斑塊的形成。結(jié)果表明，哌唑嗪能夠降低TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，并通過HE染色觀察到高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的面積在使用哌唑嗪后明顯減少。

動脈粥樣硬化是由多種炎性介質(zhì)介導(dǎo)的一種慢性炎性反應(yīng)，其進展過程中始終伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的重構(gòu)，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的增生與遷移，分泌大量的ECM[7]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組同源的酶活性依賴鈣離子(Ca2+)和鋅離子(Zn2+)的中性蛋白酶，主要由巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌，這些酶原狀態(tài)的MMPs可被細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素(IFN)、血小板源性生長因子刺激激活?；罨腗MPs能特異性地與ECM各成分相結(jié)合，降解胞外基質(zhì)，促進斑塊破裂[8]。MMP-1在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)主要裂解纖維帽中的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原纖維。有研究表明,動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展過程也是ECM重建的過程，在動脈粥樣硬化形成的不同階段和不同部位，ECM的合成與降解速度是不同的，當(dāng)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)增強，ECM的降解速度大于合成速度時，斑塊表面的纖維帽變薄，對機械外力的抵抗作用減弱，最終會導(dǎo)致斑塊破裂[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)能夠平衡這一作用，不但能夠抑制MMPs活性，而且參與組織結(jié)構(gòu)的建立與維持，決定平滑肌細(xì)胞周圍的基質(zhì)蛋白裂解程度[10]。TIMP-1在生理狀態(tài)下主要由平滑肌細(xì)胞表達，在體內(nèi)通過結(jié)合MMP-1形成非共價的復(fù)合物，阻斷MMP-1與底物的結(jié)合，從而限制MMP-1降解膠原的作用[11]。本實驗主動脈MMP-1、TIMP-1免疫組織化學(xué)染色顯示，相較于正常飲食組，高脂飲食組、哌唑嗪組的MMP-1蛋白表達水平升高，TIMP-1蛋白表達水平降低，且哌唑嗪組MMP-1蛋白表達水平明顯低于高脂飲食組，TIMP-1蛋白表達水平明顯高于高脂飲食組，提示哌唑嗪能降低斑塊內(nèi)MMP-1蛋白水平的表達，增加TIMP-1蛋白水平的表達，從而延緩動脈粥樣斑塊的發(fā)展，提高斑塊的穩(wěn)定性，這可能也是哌唑嗪抗動脈粥樣硬化的機制之一。

降脂藥物在臨床已經(jīng)被廣泛運用于動脈粥樣硬化的預(yù)防治療，效果確切，但臨床上患者常合并多種疾病，如何應(yīng)用單一用藥實現(xiàn)多功效及個體化用藥的問題尚需進一步探討。選擇性的α1受體阻滯劑哌唑嗪是臨床常見降壓藥，本研究通過探討哌唑嗪降壓外的調(diào)脂和抗動脈粥樣硬化作用，挖掘這種老藥的新用途，為臨床高血壓合并高脂血脂及動脈粥樣硬化的患者，在用藥選擇方面提供新的思路，也為臨床防治動脈粥樣硬化提供一種新的選擇。

[1]Bur A，Woisetschl?ger C，Herkner H，et al．Effects of terazosine and atenolol on serum lipids in essential hypertension[J]．Z Kardiol，2002，91(9)：685-692.

[2]胡發(fā)明．哌唑嗪對非胰島素依賴型糖尿病伴高血壓患者血壓,血糖和血脂代謝的影響[J]．世界臨床藥物,1992，13(2)：118-119．

[3]陳玲，陳曼華，裘琳，等．特拉唑嗪的調(diào)脂和抗動脈粥樣硬化作用及對熱休克蛋白70表達的影響[J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(5)：378-382．

[4]陳玲，陳曼華，汪亞蕓，等．特拉唑嗪對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響[J]．中華實驗外科雜志，2014，31(4)：713-715．

[5]Sakkinen P，Abbott RD，Curb JD，et al．C-reactive protein and myocardial infarction[J]．J Clin Epidemiol，2002，55(5)：445-451．

[6]Breslow JL．Mouse models of atherosclevosis[J]．Science，1996，272(5262)：685-688.

[7]Cui L，F(xiàn)eng L，Zhang ZH，et al．The anti-inflammation effect of baicalin on experimental colitis through inhibiting TLR4/NF-κB pathway activation[J]．Int Immunopharmacol，2014，23(1)：294-303.

[8]Alexander MR，Moehle CW，Johnson JL，et al．Genetic inactivation of IL-1 signaling enhances atherosclerotic plaque instability and reduces outward vessel remodeling in advanced atherosclerosis in mice[J]．J Clin Invest，2012，122(1)：70-79.

[9]Galis ZS，Khatri JJ．Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis:the good,the bad,and the ugly[J]．Circ Res，2002，90(3)：251-262.

[10]Tun X，Yasukawa K，Yamada K．Involvement of nitric oxide with activation of Toll-like receptor 4 signaling in mice with dextran sodium sulfate-induced colitis[J]．Free Radic Biol Med，2014(74)：108-117．

[11]余丹青，陳紀(jì)言，李光，等．基質(zhì)金屬蛋白酶與冠狀動脈斑塊穩(wěn)定性相關(guān)研究[J]．中國循環(huán)雜志，2003，18(2)：105-107．

Effect of prazosin on MMP-1 and TIMP-1 expression in atherosclerosis plaque of ApoE-/-mice model*

ChenLing，YuYang，ChenManhua△

(DepartmentofCardiology,WuhanMunicipalCentralHospital,Wuhan,Hubei430014,China)

ObjectiveTo observe the effects of prazosin on matrix metalloproteinase-1(MMP-1) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) expression in atherosclerosis plaque of ApoE knock-out(ApoE-/-) mice model and to explore its anti-atherosclerotic effect and mechanism.MethodsTwenty-four 8-week-old ApoE-/-mice were randomly divided into the normal diet group,high-fat diet group and prazosin group,8 cases in each group.The normal diet group was fed by common fodder,while the high fat group and prazosin group were fed by high fat diet;on the basis of the high fat diet,the prazosin group was started to conduct gavage of prazosin hydrochloride 1 mg/kg every day,while the normal diet group and the high fat diet group were daily gavaged by the same volume of normal saline.The abdominal aortic venous blood after 12 weeks in each group was collected for detecting the blood lipid levels.The aorta arterial blood sample was collected for detecting MMP-1 and TIMP-1 expression levels by immunohistochemistry.ResultsCompared with the high fat diet group,the levels of serum TG,TC and LDL-C in the prazosin group were significantly decreased,and the HDL-C level was increased,the differences were statistically significant(P<0.01 orP<0.05); the area of aorta arterial atherosclerotic plaque and intima thickness were significantly increased,while prazosin could significantly inhibit the plaque formation and intima hyperplasia;compared with the normal diet group,the expression level of MMP-1 protein in the high fat diet group and prazosin group was significantly increased,while the TIMP-1 protein expression level was decreased,moreover the MMP-1 protein expression level in the prazosin group was lower than that in the high fat diet group,while the TIMP-1 protein expression level was higher than that in the high fat diet group,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionPrazosin can decrease the level of TC and LDL-C,increase the HDL-C level and has certain anti-atherosclerotic effect,its mechanism may be related with the decrease of the MMP-1 level and the increase of the TIMP-1 level in plaque.

prazosin；atherosclerosis；matrix metalloproteinase-1；tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.005

武漢市科技局關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)項目(2013060602010256)。作者簡介：陳玲(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事動脈粥樣硬化研究?！?/p>

，E-mail:sjcmh@yahoo.com.cn。

R543.5

A

1671-8348(2016)19-2606-04

2016-01-12

2016-03-15)