蔡黎麗, 徐　晟, 馬　蕊, 汪　仁, 夏　冰,①

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京210014； 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái), 江蘇 南京210014〕

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忽地笑γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因LaTMT的克隆與表達(dá)分析

蔡黎麗1,2, 徐晟1, 馬蕊1, 汪仁1,2, 夏冰1,2,①

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京210014； 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái), 江蘇 南京210014〕

采用RACE技術(shù)從忽地笑〔Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.〕葉片中克隆獲得γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)基因，命名為L(zhǎng)aTMT。序列分析結(jié)果顯示：該基因cDNA全長(zhǎng)1 458 bp，其中開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 017 bp，編碼338個(gè)氨基酸殘基。LaTMT基因編碼蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量37 560，理論等電點(diǎn)pI 8.70，為親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)但具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；并具有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域，包含3個(gè)SAM結(jié)合位點(diǎn)；該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的無(wú)規(guī)則卷曲、12.72%的延伸鏈和10.36%的β-轉(zhuǎn)角。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：LaTMT蛋白屬于S-腺苷甲硫氨酸-依賴性γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶家族，與其他植物γ-TMT蛋白的一致性為64%～75%；在NJ系統(tǒng)樹上，LaTMT蛋白與單子葉植物γ-TMT蛋白聚為同一大類，并與油棕(ElaeisguineensisJacq.)EgTMT和美洲油棕〔Elaeisoleifera(Kunth) Cortés〕EoTMT聚為同一類，親緣關(guān)系最近?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示：LaTMT基因可在大腸桿菌中成功表達(dá)，且表達(dá)量隨異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；在忽地笑的根、葉片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鱗莖中LaTMT基因均可表達(dá)，其中在葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高，在子房、雄蕊和鱗莖中的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低，具有明顯的組織特異性。研究結(jié)果表明：忽地笑LaTMT基因在進(jìn)化過(guò)程中具有很高的保守性；該基因主要定位于葉綠體中，并與忽地笑對(duì)非生物逆境脅迫的抗性相關(guān)。

忽地笑;γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因; 基因克隆; 序列分析; 表達(dá)分析

維生素E(VE)是維持人類和動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖所必需的重要物質(zhì)，在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用[1-3]。植物中的VE通常在光合器官中合成和積累，植物中合成的VE包括生育酚(tocopherol)和生育三烯酚(tocotrienol)，根據(jù)其芳香環(huán)上甲基的位置和數(shù)目的不同，還可分為α、β、γ和δ4種[4]，其中α-生育酚的活性最高。

VE在合成過(guò)程中首先生成γ和δ型，然后在γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)的催化作用下分別生成α和β型[5-6]，并且α和β型VE活性較高，因此，γ-TMT是決定植物中VE成分和活性的關(guān)鍵酶。目前，研究者已對(duì)多種植物的γ-TMT基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析，例如，過(guò)量表達(dá)擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕的γ-TMT基因，可使其葉片中α-生育酚的比例從87.5%提高到97.1%[7]；過(guò)量表達(dá)芥菜〔Brassicajuncea(Linn.) Czern.〕的γ-TMT基因，可使其葉片中α-生育酚的含量提高6倍[8]。因此，克隆不同物種的γ-TMT基因并進(jìn)行深入研究對(duì)改良植物VE的品質(zhì)和性狀具有重要意義。

忽地笑〔Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.〕是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(LycorisHerb.)多年生草本植物，具有重要的觀賞和藥用價(jià)值。目前，已從忽地笑鱗莖中提取獲得包括加蘭他敏(galanthamine)在內(nèi)的多種石蒜科生物堿，臨床上用于治療阿爾茨海默氏病和小兒麻痹癥等疾病[9]。作者所在課題組根據(jù)忽地笑的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從中篩選了部分可能參與忽地笑體內(nèi)加蘭他敏生物合成的相關(guān)基因片段[10]。

在上述研究的基礎(chǔ)上，本課題組獲得了N甲基轉(zhuǎn)移酶(NMT)候選基因片段，且利用RACE技術(shù)克隆得到1個(gè)忽地笑γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)等研究，以期為石蒜屬植物功能基因的合理開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)，并為藥用植物資源的深度利用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

供試多年生忽地笑葉片采自江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所試驗(yàn)場(chǎng)。

原核表達(dá)載體pET28a、大腸桿菌菌株TOP10和BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司；T4DNA連接酶、pMD19-T載體、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)、LA-TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaqTMⅡ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；植物RNA提取試劑Trizol、10×PCR buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs mixture和DL2000 DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)于上海浦迪生物科技有限公司。引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成；由南京伯津生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2方法

1.2.1葉片總RNA的提取參照植物RNA提取試劑說(shuō)明書，稱取盛葉期的忽地笑單株嫩葉約0.2 g，于液氮中充分研磨， 加入1 mL Trizol振蕩混勻后放置5 min；加入0.2 mL三氯甲烷，振蕩15 s，并靜置2～3 min，12 000g離心15 min；取上層水相，加入2倍體積無(wú)水乙醇，于-20 ℃靜置30 min， 12 000g離心10 min； 沉淀用1 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2遍，然后用RNase-free水溶解，最后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度及完整性。

1.2.2全長(zhǎng)cDNA的克隆和測(cè)序根據(jù)忽地笑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇注釋為γ-TMT的基因片段，設(shè)計(jì)5′-端序列和3′-端序列的擴(kuò)增引物(表1)。RACE擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s、52 ℃退火25 s、72 ℃延伸50 s，共38個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用回收試劑盒回收片段；連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。

用Vetor NTI軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并根據(jù)擴(kuò)增片段的重疊部分對(duì)已知基因片段序列、5′-端擴(kuò)增片段序列和3′-端擴(kuò)增片段序列進(jìn)行拼接，得到該基因的全長(zhǎng)cDNA序列；隨后用在線軟件ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)找出開放閱讀框(ORF)，根據(jù)pET28a載體圖設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ的引物L(fēng)aTMT-pETR和LaTMT-pETF(表1)；接著用LA-TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增其編碼區(qū)序列，具體PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[11]?；厥誔CR擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物并連接pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-LaTMT，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序，保留測(cè)序正確的菌液。

表1忽地笑LaTMT基因克隆及表達(dá)分析采用的引物序列

Table 1Primer sequences used for gene cloning and expression analysis ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

引物 Primer序列(5'→3') Sequence(5'→3')用途 ApplicationLaTMT3'-RACE-R1AGATGCATTAGACCAA3'-RACELaTMT3'-RACE-R2GGGAAAGTTTGTTAGCG3'-RACELaTMT5'-RACE-F1TGAATGCTGATCGGAT5'-RACELaTMT5'-RACE-F2TCATCGGGTCGTAGTGT5'-RACELaTMT-ORFFATGCGCACACTCCTCCACACGTG擴(kuò)增開放閱讀框(ORF)Amplificationofopenreadingframe(ORF)LaTMT-ORFRCTCTGGTTTACGGCATGTA擴(kuò)增開放閱讀框(ORF)Amplificationofopenreadingframe(ORF)LaTMT-pETRATCGGGATCCCGGTC-CAGTCGAACCG原核表達(dá)分析ProkaryoticexpressionanalysisLaTMT-pETFATCGAAGCTTCTCTGGTTTACG-GCAT原核表達(dá)分析ProkaryoticexpressionanalysisLaActinFATCCAGGCCGTCCTTTC擴(kuò)增內(nèi)參基因AmplificationofreferencegeneLaActinRTGGAAGAGAACCTCTGGGCA擴(kuò)增內(nèi)參基因AmplificationofreferencegeneLaTMT-RTRGGGGTTAGGAGACAAAGTAT檢測(cè)LaTMT基因相對(duì)表達(dá)水平DetectionofrelativeexpressionofLaTMTgeneLaTMT-RTFTTTCATCGGGTCGTAGTG檢測(cè)LaTMT基因相對(duì)表達(dá)水平DetectionofrelativeexpressionofLaTMTgene

1.2.3序列分析用BLASTp程序(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利用DNAman對(duì)LaTMT蛋白及與其同源的其他植物的γ-TMT氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，采用MEGA5.0軟件中neighbor-joining(NJ)法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建；利用ExPASy軟件(http:∥web.expasy.org/protparam/)計(jì)算蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)、理論相對(duì)分子質(zhì)量、親水性和疏水性等；用在線軟件ChloroP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)查找序列N端信號(hào)肽；利用在線軟件SOPMA(http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)LaTMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SWISS-MODEL軟件(http:∥swissmodel.expasy.org/)對(duì)LaTMT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)PROSITE(http:∥prosite.expasy.org)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LaTMT蛋白的功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4基因的原核表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測(cè)對(duì)重組質(zhì)粒pMD-LaTMT和空載體pET28a分別進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收酶切產(chǎn)物；回收片段經(jīng)T4DNA連接酶連接以獲得重組質(zhì)粒pET28a-LaTMT，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET28a-LaTMT和空載體pET28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

將轉(zhuǎn)入空載體pET28a和重組質(zhì)粒pET28a-LaTMT的BL21菌株分別接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后將菌液轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，直至其OD600達(dá)到0.2，隨后加入終濃度1 mmol·L-1異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；選取IPTG誘導(dǎo)0、3、6、9和19 h的菌液1 mL，12 000g離心5 min，棄上清液并加入200 μL無(wú)菌水重懸菌體，同時(shí)加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，置于沸水浴中加熱10 min，室溫下離心20 min；取30 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，并記錄分析結(jié)果。

1.2.5組織表達(dá)特性分析在忽地笑花期稱取根、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鱗莖約0.1 g，在盛葉期稱取葉片約0.1 g，液氮速凍后迅速置于-70 ℃冰箱保存；參照植物RNA提取試劑說(shuō)明書提取不同組織的總RNA，用Random Primer經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，分別根據(jù)內(nèi)參基因LaActin和LaTMT基因的特異引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系總體積15.0 μL，包含2.0 μL cDNA模板、7.5 μL 2×SYBR PremixExTaqⅡ、10.0 μmol·L-1上游和下游引物各0.1 μL、5.3 μL 重蒸水。 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，利用2-ΔΔCt法分析其相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果和分析

2.1LaTMT基因的克隆和序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增，分別得到LaTMT基因片段的5′-端和3′-端序列(圖1)；去除載體序列后，將測(cè)序驗(yàn)證正確的5′-端擴(kuò)增片段(961 bp)和3′-端擴(kuò)增片段(956 bp)與LaTMT基因已知序列進(jìn)行拼接，得到1條長(zhǎng)度為1 458 bp的全長(zhǎng)cDNA序列；經(jīng)ORF Finder軟件預(yù)測(cè)該基因的ORF長(zhǎng)度為1 017 bp(圖2)。對(duì)該基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行BLASTx分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有典型的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域，因此，將該基因命名為L(zhǎng)aTMT。根據(jù)預(yù)測(cè)得到的ORF序列設(shè)計(jì)特異引物L(fēng)aTMT-ORFF和LaTMT-ORFR，并以反轉(zhuǎn)錄得到的忽地笑cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 100 bp的ORF片段(圖1)，與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

M: DL2000 marker; 1,3: 5′-RACE; 2,4: 3′-RACE; 5: 開放閱讀框Open reading frame.

圖1忽地笑LaTMT基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig. 1PCR amplification result ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

*： 終止密碼子 Stop condon.

圖2忽地笑LaTMT基因全長(zhǎng)核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

Fig. 2Full nucleotide sequence ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. and its amino acid sequence encoded

2.2LaTMT基因編碼的氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

對(duì)LaTMT基因編碼的氨基酸序列的分析結(jié)果表明：LaTMT蛋白包含338個(gè)氨基酸殘基(圖2)，理論相對(duì)分子質(zhì)量37 560，理論等電點(diǎn)pI 8.70；LaTMT蛋白在N端有44個(gè)氨基酸的導(dǎo)肽；在LaTMT蛋白序列中，從41～338位的298個(gè)氨基酸具有SAM-依賴性γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(SAM_GTMT)家族特征(圖3)。此外，該蛋白還具有3個(gè)SAM結(jié)合位點(diǎn)，分別位于120～129、183～191和210～219位氨基酸處。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：該蛋白中含有大量的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲以及少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈；總體上，LaTMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的無(wú)規(guī)則卷曲、12.72%的延伸鏈和10.36%的β-轉(zhuǎn)角。

以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的紅藻(GaldieriasulphurariaP. De Luca, R. Taddei et L. Varano)肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶為模板(其與LaTMT蛋白的同源性為23.99%)，對(duì)LaTMT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，結(jié)果(圖4)顯示： LaTMT蛋白含有較多的α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角只占少數(shù)。

下劃線表示SAM結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基 The underlines indicate amino acid residues of SAM binding sites.

圖3忽地笑LaTMT基因編碼的氨基酸序列的功能位點(diǎn)分析

Fig. 3Functional site analysis on amino acid sequence encoded byLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

圖4忽地笑LaTMT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig. 4Tertiary structure ofLaTMTproteinfromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

2.3LaTMT基因編碼的氨基酸序列的同源性及進(jìn)化分析

對(duì)忽地笑LaTMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物的γ-TMT蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：LaTMT與油棕(ElaeisguineensisJacq.)的EgTMT、美洲油棕〔Elaeisoleifera(Kunth) Cortés〕的EoTMT、陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)的GhTMT、橡膠樹〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕的HbTMT、可可(TheobromacacaoLinn.)的TcTMT、小麥(TriticumaestivumLinn.)的TaTMT和玉米(ZeamaysLinn.)的ZmTMT的一致性達(dá)64%～75%。多重比對(duì)結(jié)果(圖5)顯示：忽地笑LaTMT基因編碼的氨基酸序列與上述植物γ-TMT蛋白的氨基酸序列具有較大的保守區(qū)域，同時(shí)連續(xù)相同的氨基酸殘基數(shù)目較多，表明植物的γ-TMT蛋白具有較高的保守性。

1: 忽地笑Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.; 2: 油棕ElaeisguineensisJacq.; 3: 美洲油棕Elaeisoleifera(Kunth) Cortés; 4: 陸地棉GossypiumhirsutumLinn.; 5: 橡膠樹Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.; 6: 可可TheobromacacaoLinn.; 7: 小麥TriticumaestivumLinn.; 8: 玉米ZeamaysLinn.

圖5忽地笑LaTMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物γ-TMT的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果

Fig. 5Result of multiple alignment between amino acid sequence encoded byLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. andγ-TMT amino acid sequence from other species

選取與LaTMT蛋白的氨基酸序列一致性大于60%的植物的γ-TMT序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明：不同植物的γ-TMT蛋白可分成單子葉植物源和雙子葉植物源2大類，反映出γ-TMT蛋白的進(jìn)化與其物種進(jìn)化高度一致。此外，同一科屬植物的γ-TMT蛋白聚在同一個(gè)分支上。例如：?jiǎn)巫尤~植物中，禾本科(Poaceae)的小麥、大麥(HordeumvulgareLinn.)、水稻(OryzasativaLinn.)和玉米的γ-TMT蛋白同屬一個(gè)分支, 親緣關(guān)系較近；忽地笑LaTMT蛋白與棕櫚科(Arecaceae)的美洲油棕和油棕的γ-TMT蛋白親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上，說(shuō)明它們的進(jìn)化地位可能一致。雙子葉植物中，同為茄科(Solanaceae)的SolanumlycopersicumLinn.和馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)的γ-TMT蛋白親緣關(guān)系最近，聚在同一分支；菊科(Asteraceae)的CarthamusoxyacanthusBieb.、紅花(CarthamustinctoriusLinn.)、向日葵(HelianthusannuusLinn.)和萵苣(LactucasativaLinn.)的γ-TMT蛋白聚在同一分支；豆科(Fabaceae)的大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)和百脈根(LotuscorniculatusLinn.)的γ-TMT蛋白的親緣關(guān)系最近，形成同一分支；十字花科(Brassicaceae)的歐洲油菜(BrassicanapusLinn.)和擬南芥的γ-TMT蛋白屬于同一分支，而錦葵科(Malvaceae)的陸地棉和可可的γ-TMT蛋白也聚在同一分支上。γ-TMT的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與各物種的經(jīng)典分類關(guān)系基本一致。

2.4LaTMT基因的原核表達(dá)分析

由于LaTMT蛋白的N端具有預(yù)測(cè)的葉綠體導(dǎo)肽，而對(duì)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，導(dǎo)肽的存在可能影響重組酶的表達(dá)及功能。因此，本研究在原核表達(dá)的時(shí)候，設(shè)計(jì)了1對(duì)用以擴(kuò)增LaTMT成熟蛋白編碼區(qū)的引物L(fēng)aTMT-pETR和LaTMT-pETF。在構(gòu)建LaTMT基因原核表達(dá)載體后，將轉(zhuǎn)入空載體pET28a和重組質(zhì)粒pET28a-LaTMT的表達(dá)宿主菌進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含重組質(zhì)粒pET28a-LaTMT的表達(dá)宿主菌出現(xiàn)1條相對(duì)分子質(zhì)量約37 000的條帶(圖7)，與預(yù)測(cè)的LaTMT蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明目標(biāo)蛋白LaTMT成功表達(dá)。此外，隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，LaTMT蛋白的表達(dá)量有顯著的增加。

1: 大麥HordeumvulgareLinn.; 2: 小麥TriticumaestivumLinn.; 3: 水稻OryzasativaLinn.; 4: 玉米ZeamaysLinn.; 5: 忽地笑Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.; 6: 油棕ElaeisguineensisJacq.; 7: 美洲油棕Elaeisoleifera(Kunth) Cortés; 8:SolanumlycopersicumLinn.; 9: 馬鈴薯SolanumtuberosumLinn.; 10:CarthamusoxyacanthusBieb.; 11: 紅花CarthamustinctoriusLinn.; 12: 向日葵HelianthusannuusLinn.; 13: 萵苣LactucasativaLinn.; 14: 大豆Glycinemax(Linn.) Merr.; 15: 蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaGaertn.; 16: 百脈根LotuscorniculatusLinn.; 17: 擬南芥Arabidopsisthaliala(Linn.) Heynh.; 18: 歐洲油菜BrassicanapusLinn.; 19: 陸地棉GossypiumhirsutumLinn.; 20: 可可TheobromacacaoLinn. 分支上的數(shù)據(jù)代表自展值Datums above the branches indicate bootstrap values. Ⅰ： 單子葉植物 Monocotyledon； Ⅱ： 雙子葉植物Dicotyledon.

圖6忽地笑LaTMT蛋白與其他植物γ-TMT蛋白的NJ系統(tǒng)樹

Fig. 6NJ phylogenetic tree of LaTMT protein fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. andγ-TMT protein from other species

2.5忽地笑不同組織中LaTMT基因的表達(dá)分析

以忽地笑LaActin基因?yàn)閮?nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析LaTMT基因的組織表達(dá)模式，結(jié)果見圖8。由圖8可見：LaTMT基因在忽地笑的根、葉片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鱗莖中均有表達(dá)，且葉片中相對(duì)表達(dá)量最高，子房、雄蕊和鱗莖中相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低。表明LaTMT基因的表達(dá)具有一定的特異性。

M: Marker; 0,3,6,9,19: 分別經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)0、3、6、9和19 hInduced expression by isopropyl thiogalactoside for 0, 3, 6, 9 and 19 h, respectively. 箭頭示目標(biāo)蛋白 The arrow indicates the target protein.

圖7忽地笑pET28a-LaTMT在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜

Fig. 7SDS-PAGE electrophoresis pattern of pET28a-LaTMT ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb. expressed inEscherichiacoli

圖8忽地笑不同組織中LaTMT基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 8Relative expression ofLaTMTgene in different tissues ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

3　討論和結(jié)論

采用RACE方法從忽地笑中克隆得到γ-TMT基因，并命名為L(zhǎng)aTMT，該基因cDNA全長(zhǎng)1 458 bp，開放閱讀框?yàn)? 017 bp，編碼1個(gè)具有338個(gè)氨基酸殘基的多肽。LaTMT蛋白在N端有44個(gè)氨基酸的葉綠體導(dǎo)肽，負(fù)責(zé)引導(dǎo)未成熟的LaTMT進(jìn)入葉綠體，因此，LaTMT蛋白可能主要在葉綠體中行使功能，這與“擬南芥、玉米和馬鈴薯等種類的γ-TMT主要定位在葉綠體基質(zhì)中[12]”的結(jié)果相一致。LaTMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物的γ-TMT基因編碼的氨基酸序列一致性均在64%以上，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上具有高度保守性。LaTMT蛋白與其他物種γ-TMT蛋白具有相似的保守域，且在NJ系統(tǒng)樹上與美洲油棕和油棕的γ-TMT同源蛋白親緣關(guān)系較近，進(jìn)一步說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程具有很高的保守性。此外，LaTMT基因?qū)儆赟AM-GTMT基因家族中的1個(gè)成員。

LaTMT基因在忽地笑的不同組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高。Dellapenna[6]認(rèn)為生育酚的合成主要在高等植物的葉綠體中進(jìn)行，因此LaTMT基因在葉片中的高度表達(dá)可能與此有關(guān)；而LaTMT蛋白N端具有葉綠體導(dǎo)肽的推測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)論。VE在提高植物自身對(duì)非生物逆境脅迫的抗性(抗光氧化、抗寒、抗旱和抗鹽堿等)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也有重要作用[13-16]，而通過(guò)γ-TMT基因的表達(dá)提高植物體中VE含量則可以緩解非生物脅迫對(duì)其造成的損傷[17-18]。忽地笑對(duì)土壤水分、溫度、酸堿性、蔭蔽等環(huán)境因子的有極強(qiáng)的耐受性，推測(cè)LaTMT基因可能在其非生物脅迫抗性中起作用。此外，對(duì)LaTMT基因所具有的功能還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

Cloning and expression analysis onγ-tocopherol methyltransferase geneLaTMTfromLycorisaurea

CAI Lili1,2, XU Sheng1, MA Rui1, WANG Ren1,2, XIA Bing1,2,①

(1. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China; 2. The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(1): 1-8

Using RACE method,γ-tocopherol methyltransferase (γ-TMT) gene was cloned from leaf ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb., which was namedLaTMT. The result of sequence analysis shows that full-length cDNA ofLaTMTgene is 1 458 bp, in which, length of open reading frame (ORF) is 1 017 bp, and 338 amino acid residues are encoded. Theoretical relative molecular mass of the protein encoded byLaTMTgene is 37 560, theoretical isoelectric point is pI 8.70, which is a hydrophilic protein without transmembrane structure but with signal peptide structure. And this protein hasS-adenosylmethionine (SAM) methyltransferase conserved domain and includes three SAM binding sites. Its tertiary structure includes 44.08% ofα-helix, 32.84% of random coil, 12.72% of extended strand and 10.36% ofβ-turn. The analysis results of sequence alignment and phylogenetic tree show that LaTMT protein belongs toS-adenosylmethionine-dependentγ-tocopherol methyltransferase family, and its identity withγ-TMT protein from other plants is 64%-75%. In NJ phylogenetic tree, LaTMT protein andγ-TMT protein from monocotyledon are clustered into the same large category, and this protein with EgTMT ofElaeisguineensisJacq. and EoTMT ofElaeisoleifera(Kunth) Cortés is clustered into the same category, their relationship is close. The analysis result of genetic expression shows thatLaTMTgene can express successfully inEscherichiacoli, and its expression increases with prolonging of inducing time of isopropyl thiogalactoside (IPTG). Also,LaTMTgene can express in root, leaf, bud, ovary, stamen, petal and bulb ofL.aurea, in which, relative expression is the highest in leaf, and that is relative low in ovary, stamen and bulb, with obvious tissue specificity. It is suggested thatLaTMTgene fromL.aureahas high conservation in evolutionary process, the gene is mainly located in chloroplast and is related to resistance of abiotic adversity stress.

Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.;γ-tocopherol methyltransferase gene; gene cloning; sequence analysis; expression analysis

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.01.01

2015-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301798; 31270339); 江蘇省科技計(jì)劃產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金——前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2014131); 江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(QD201302); 江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目蘇北科技發(fā)展計(jì)劃——科技富民強(qiáng)縣項(xiàng)目(SBN201310073)

蔡黎麗(1991—)，女，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事藥用植物學(xué)方向的研究。

Q785; Q943.2; Q949.71+8.25

A

1674-7895(2016)01-0001-08