黃勝男, 張計育, 毛妮妮, 王　剛, 宣繼萍, 賈曉東, 翟　敏, 郭忠仁,①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014; 2. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 鎮(zhèn)江 212400〕

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美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片不定芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)基篩選

黃勝男1, 張計育1, 毛妮妮2, 王剛1, 宣繼萍1, 賈曉東1, 翟敏1, 郭忠仁1,①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014; 2. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 鎮(zhèn)江 212400〕

美味獼猴桃； 離體葉片； 誘導(dǎo)培養(yǎng)基； 生根培養(yǎng)基

獼猴桃(Actinidiaspp.)果實酸甜適中，含豐富的VC和多種礦質(zhì)元素及氨基酸，其種子中還含有大量的亞麻酸、不飽和脂肪酸等成分[1]，被譽為“水果之王”。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果茶蠶桑研究所從野生獼猴桃品種‘竹溪2號’(‘Zhuxi No. 2’)中實生馴化選育出美味獼猴桃〔Actinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.〕品種‘金魁’(‘Jinkui’)[2]，其果實耐貯性強[3]、植株較抗?jié)?，適宜在易澇地區(qū)種植。

獼猴桃屬植物為雌雄異株植物，采用種子播種的繁殖方式易造成品種退化，難以保持母本的優(yōu)良性狀[4]；而采用嫁接和扦插的繁殖方法則分別存在周期長、成活率低等問題[5]，并且在栽培過程中易發(fā)生病害[6]。采用組織培養(yǎng)法獲得的試管苗能保持品種的優(yōu)良性狀，且性狀穩(wěn)定、繁殖速度快[7]。作者以美味獼猴桃品種‘金魁’組培無菌苗葉片為實驗材料，對其不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基進行篩選，以期建立高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系，為獼猴桃優(yōu)良品種的繁殖推廣奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

美味獼猴桃品種‘金魁’ 種植于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所經(jīng)濟植物研究中心實驗基地，于2015年2月從田間剪取枝條進行水培，待長出新芽后剝?nèi)バ卵康镊[片和展開的葉片，在無菌操作臺上依次用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇處理30 s，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2處理8 min，無菌水沖洗5遍；吸干表面水分后，接種到添加了2.0 mg·L-16-BA 和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基(含30 g·L-1蔗糖和5.6～5.8 g·L-1瓊脂粉， pH 5.8)上， 在溫度(22±2) ℃、 光照時間16 h·d-1、 光照度1 500 lx條件下培養(yǎng)獲得無菌苗， 培養(yǎng)3或4代后進行實驗。

1.2方法

1.2.1不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加2.0和3.0 mg·L-16-BA以及0.1、0.2和0.3 mg·L-1NAA，共6種激素組合。以上述無菌苗葉片為外植體，每種培養(yǎng)基接種12個外植體(接種2瓶，每瓶6個)，重復(fù)3次。在上述培養(yǎng)條件下先暗培養(yǎng)21 d(經(jīng)預(yù)實驗確定)，再光照培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計再生不定芽的外植體數(shù)和不定芽再生率。

1.2.2不定芽生根培養(yǎng)基的篩選將葉片上再生的不定芽分別接種到添加0.5、0.6、0.7和0.8 mg·L-1IBA的1/2MS培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基接種12個不定芽(接種2瓶，每瓶6個)，重復(fù)3次。在上述培養(yǎng)條件下光照培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計生根的不定芽數(shù)和不定芽生根率。

1.3數(shù)據(jù)處理

按照公式“再生率=(再生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%”；“生根率=(生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù))×100%”計算不定芽的再生率和生根率；并采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA，P=0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

在添加不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片再生不定芽。6種激素水平下，‘金魁’離體葉片不定芽的再生狀況見表1?！鹂x體葉片的再生過程見圖1。

由表1可見：在含有3.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，不定芽再生率最高，達到94.4%，基本上顯著高于其他培養(yǎng)基(P=0.05)，且不定芽數(shù)量最多、長勢最好，莖葉分化最為明顯；在含有3.0 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，不定芽再生率也較高，為83.3%，且不定芽數(shù)量也較多、長勢較好；而在含有2.0 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，不定芽再生率最低，為41.7%，基本上顯著低于其他培養(yǎng)基，且不定芽數(shù)量少、長勢較差。因此，‘金魁’離體葉片不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為含有3.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基。

表1在含有不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片不定芽再生狀況的比較1)

Table 1Comparison on regeneration status of adventitious buds frominvitroleaf of cultivar ‘Jinkui’ ofActinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev. ) A. Chev. on MS media containing different mass concentrations of 6-BA and NAA1)

質(zhì)量濃度/mg·L-1Massconcentration6-BANAANIENRE R/%2.00.1361541.7±8.3d2.00.2362055.6±9.6cd2.00.3362775.0±0.0b3.00.1363083.3±8.3ab3.00.2363494.4±4.8a3.00.3362569.4±12.7bc

1)NIE: 接種的外植體數(shù)Number of inoculated explants; NRE: 再生不定芽的外植體數(shù)Number of explants with adventitious bud; R: 不定芽再生率Regeneration rate of adventitious bud. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P=0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P=0.05).

A: 接種的離體葉片Inoculatedinvitroleaves; B: 經(jīng)光照培養(yǎng)后形成的不定芽Adventitious buds formed by light culture; C: 由單個不定芽形成的叢生芽Multiple buds from single adventitious bud; D: 生根的不定芽 Adventitious buds rooted.

圖1美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片的再生過程

Fig. 1Regeneration process ofinvitroleaf of cultivar ‘Jinkui’ ofActinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev. ) A. Chev.

將 ‘金魁’的離體葉片接種到不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)20 d后，離體葉片即可再生出嫩綠色小芽，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后小芽漸變成深綠色(圖1-A,B)；培養(yǎng)35 d后可長成叢芽(圖1-C)。

2.2不定芽生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

在添加不同質(zhì)量濃度IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)美味獼猴桃品種‘金魁’不定芽的生根，其生根狀況見表2。

由表2可見：隨著IBA濃度的逐漸升高，‘金魁’不定芽的生根率逐漸升高，其中，在含有0.7 mg·L-1IBA的1/2MS培養(yǎng)基上不定芽的生根效果最好，培養(yǎng)35 d后生根率達到100.0%，生根率顯著高于其他培養(yǎng)基(P=0.05)，且不定根數(shù)量最多；而當(dāng)IBA濃度達到0.8 mg·L-1時，生根率又出現(xiàn)降低的情況(僅為55.6%)，這說明IBA濃度過高會對‘金魁’不定芽生根產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，‘金魁’不定芽生根的最適培養(yǎng)基為含有0.7 mg·L-1IBA的1/2MS培養(yǎng)基。在此生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)20 d后不定芽即發(fā)生不定根，培養(yǎng)35 d后可形成良好根系(圖1-D)。

表2在含有不同質(zhì)量濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基上美味獼猴桃品種‘金魁’不定芽生根狀況的比較1)

Table 2Comparison on rooting status of adventitious buds of cultivar ‘Jinkui’ ofActinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev. ) A. Chev. on 1/2 MS media containing different mass concentrations of IBA1)

IBA質(zhì)量濃度/mg·L-1MassconcentrationofIBANIANRA生根率/%Rootingrate0.5362877.8±4.8b0.6363186.1±4.8b0.73636100.0±0.0a0.8362055.6±4.8c

1)NIA: 接種的不定芽數(shù)Number of inoculated adventitious buds; NRA: 生根的不定芽數(shù)Number of rooting adventitious buds. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P=0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P=0.05).

3　討　　論

隆前進[4]的研究結(jié)果表明：外植體類型對不定芽分化具有重要影響，在出芽率方面，葉片出芽率最高，葉柄次之?；诖耍髡咭浴鹂碾x體葉片為外植體篩選適宜其不定芽誘導(dǎo)和生根的培養(yǎng)基，結(jié)果表明：在含有3.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)21 d的不定芽再生率最高(94.4%)，在含有0.7 mg·L-1IBA的1/2MS培養(yǎng)基上不定芽的生根率最高(100.0%)，表明這2種培養(yǎng)基分別適合于美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片的不定芽誘導(dǎo)及生根。

在生根培養(yǎng)過程中，IBA濃度對生根率有影響。趙許朋等[8]的研究結(jié)果表明：當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度低于0.8 mg·L-1時，‘紅陽’獼猴桃(Actinidiachinensis‘Hongyang’)不定芽的根長、平均根數(shù)和生根率隨 IBA質(zhì)量濃度的提高而增加，而當(dāng)IBA質(zhì)量濃度高于0.8 mg·L-1時這3個指標(biāo)則降低。本實驗中，含有0.7 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基生根的效果最好，且與吳秀華等[5]建立的‘海沃德’獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa‘Hayward’)葉片再生體系中最適生根培養(yǎng)基的IBA質(zhì)量濃度一致，不定芽生根率都達到100.0%。表明不同品種獼猴桃試管苗培養(yǎng)過程中的生根培養(yǎng)條件具有一定的共性。

[1]袁云香. 獼猴桃營養(yǎng)成分的提取工藝研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(2): 221-223.

[2]陳慶紅. 獼猴桃優(yōu)良品種——金魁[J]. 果樹實用技術(shù)與信息, 2002(1): 13.

[3]黃宏文. 中國獼猴桃種質(zhì)資源[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2013.

[4]隆前進. 獼猴桃組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)研究[D]. 金華： 浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 2010.

[5]吳秀華, 張艷玲, 周月， 等. ‘海沃德’獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J]. 植物生理學(xué)報, 2013, 49(8): 759-763.

[6]汪克強, 周建峰, 王曉兵. 紅陽獼猴桃的栽培管理技術(shù)[J]. 西北園藝, 2010(6): 13-15.

[7]張海平, 周建峰, 任目瑾. 海沃德獼猴桃組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)研究[J]. 陜西林業(yè)科技, 2011(2): 8-11.

[8]趙許朋, 羅克明, 周月， 等. ‘紅陽’獼猴桃葉盤高頻直接再生體系的建立[J]. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(11): 1599-1606.

(責(zé)任編輯: 郭嚴(yán)冬)

Screening on induction and rooting media of adventitous buds frominvitroleaf of cultivar ‘Jinkui’ ofActinidiachinensisvar.deliciosa

HUANG Shengnan1, ZHANG Jiyu1, MAO Nini2, WANG Gang1, XUAN Jiping1, JIA Xiaodong1, ZHAI Min1, GUO Zhongren1,①

(1. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014， China； 2. Hilly Area of Jiangsu Province, Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212400， China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(1): 105-107

In order to establish high frequency regeneration system of cultivar ‘Jinkui’ ofActinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev. ) A. Chev., the optimum media for induction and rooting of adventitious buds were screened by takinginvitroleaf of sterile seedling as explant. The results show that the optimum medium for induction of adventitious buds of ‘Jinkui’ is MS medium containing 3.0 mg·L-16-BA and 0.2 mg·L-1NAA with regeneration rate of 94.4%. The optimum medium for rooting of adventitious buds is 1/2MS medium containing 0.7 mg·L-1IBA with rooting rate of 100.0%.

Actinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev. ) A. Chev.;invitroleaf; induction medium; rooting medium

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.01.14

2015-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(31401854); 江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20140760)； 江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——研究開發(fā)示范類項目(BE2015350)； 泰州市科技支撐計劃(農(nóng)業(yè))項目(TN201511)

黃勝男(1990—)，女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事獼猴桃分子生物學(xué)方面的研究。

S663.4; Q813.1+2

A

1674-7895(2016)01-0105-03