保鵬濤　趙衛(wèi)國　馮金棟　劉宇　李蕓　湯麗萍

?

Foxp3及其調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌患者中表達的規(guī)律及對患者生存的影響

保鵬濤趙衛(wèi)國馮金棟劉宇李蕓湯麗萍

100091 北京，中國人民解放軍第309醫(yī)院

【摘要】目的探討Foxp3及其調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌患者中表達的規(guī)律及對患者生存的影響。方法Western-blot法檢測正常肺組織、肺腺癌、鱗癌組織(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分層)中Foxp3水平。免疫組化方法觀察小細胞肺癌、腺癌、鱗癌中Foxp3蛋白表達情況；流式細胞法檢測臨床各期肺腺癌患者和健康人群血清中表達Foxp3的CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)，并觀察化療及手術(shù)對肺腺癌患者血清中Foxp3水平的影響。使用Kaplan-Meier生存曲線分析血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)與肺腺癌患者生存周期之間的關系。結(jié)果肺腺癌各期患者Foxp3表達水平和血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)均明顯高于健康人群，與腫瘤分期呈正相關，經(jīng)手術(shù)或化療干預后患者外周血清中細胞計數(shù)下降明顯。細胞計數(shù)低于平均值或化療后細胞計數(shù)變化值高于平均值的患者平均生存周期明顯高于細胞計數(shù)值高于平均值或化療后細胞計數(shù)變化值小于平均值的患者。結(jié)論Foxp3調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，對其深入研究將有助于肺腺癌的早期診斷，并可將其作為常規(guī)檢查及監(jiān)測患者預后的指標之一。

【關鍵詞】肺腺癌；Foxp3；CD4+CD25+Treg細胞；生存分析

腫瘤已經(jīng)成為當今世界上對人類健康與生命危害最大的疾病，腺癌在所有肺癌患者中占近60%，其中女性肺腺癌和男性肺腺癌分別占其肺癌總數(shù)的86.2%和47.9%，因此如何尋找更為有效治療肺癌特別是肺腺癌的方法成為目前研究的熱點[1-2]。Foxp3又稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在一些腫瘤患者血清中明顯升高，其可能是腫瘤的發(fā)病機制之一，有相關報道在非小細胞肺癌患者血清中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[3]，但未見有深入研究報告，本研究旨在系統(tǒng)探討Foxp3及其調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌患者中表達的規(guī)律以及化療和手術(shù)對它們的影響，觀察血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)與肺腺癌患者分期及生存預后之間的關系，為肺腺癌治療提供新的思路。

材料和方法

一、實驗材料

正常肺組織、肺腺癌和鱗癌組織(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分層)均來自我院中心實驗室標本庫。124例肺腺癌患者全部為2009年6月至2013年6月在我科住院經(jīng)病理學(組織或細胞)診斷為肺腺癌的患者。Foxp3的Western-blot、免疫組化、流式細胞檢測試劑盒購自上海生物科技有限公司。所有患者化療方案均使用力比泰+卡鉑方案進行化療。

二、納入/排除標準

納入標準[4-5]：①有明確病理診斷的原發(fā)性肺腺癌首次治療或接受既往治療已結(jié)束2個月以上患者(肺癌組)；②心、肝、腎、造血、免疫系統(tǒng)功能基本正常；③年齡小于75歲，KPS評分在80分以上；④自愿參加本研究， 簽署知情同意書，依從性好，可隨訪。

排除標準：①孕婦和精神病患者；②合并已經(jīng)明確的可能導致CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞水平變化的感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病等。

三、研究方法

1. 組織學Foxp3蛋白水平 ：免疫組化法分析比較小細胞肺癌和非小細胞肺癌組織中(腺癌和鱗癌)Foxp3的表達情況。Western-blot法分析比較正常肺組織20例，肺腺癌組織和鱗癌組織(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分層)各20例患者中Foxp3的水平表達情況。

2. 血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)：①肺腺癌各期患者(Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，ⅢA期20例，ⅢB期30例，Ⅳ期28例)及健康人群20例血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)；②肺腺癌患者(Ⅰ期22例，Ⅱ期24例)外科手術(shù)后及肺腺癌患者(ⅢB期30例，Ⅳ期28例)化療2周期后血中白細胞恢復正常值且穩(wěn)定3 d后血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)值。

3. 分析CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)與肺腺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)生存周期之間的關系: 以肺腺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)血清CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)平均值為界限，高于平均值的肺腺癌患者設為對照組，低于平均值的肺腺癌患者為空白組，分別隨訪記錄兩組患者生存時間，使用Kaplan-Meier生存曲線進行分析。按同樣方法進一步分析經(jīng)化療后CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)變化，比較高于平均值患者組與低于平均值患者組的生存曲線(排除年齡、分期、基礎疾病等因素影響)。

4. 隨訪調(diào)查： 每月對所有患者進行電話隨訪1次，記錄患者不良反應事件發(fā)生情況，生存情況直至患者去世或失訪。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，均數(shù)資料使用t檢驗或方差分析。使用Kaplan-Meier生存曲線比較分析不同情況下肺腺癌患者的生存周期。

結(jié)　　果

一、一般情況

本研究共采集20名健康人群血清檢測標本進行CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)，其中女性12例，男性8例；平均年齡56.1歲；30歲～45歲3例，46歲～60歲12例，61歲～75歲3例；吸煙11例，不吸煙9例。

124例肺腺癌患者，其中Ⅰ期22例、Ⅱ期24例、ⅢA期20例、ⅢB期30例、Ⅳ期28例；女性66例，男性58例；平均年齡55.6歲；30歲～45歲25例，46歲～60歲81例，61歲～75歲18例；吸煙患者71例，不吸煙患者53例；本研究入院的Ⅰ期22例、Ⅱ期24例患者均進行了手術(shù)治療，見表1。

表1　患者一般情況(n)

二、組織學Foxp3水平

免疫組化結(jié)果顯示，在肺癌組織中Foxp3表達都要強于正常肺組織，非小細胞肺癌組織中Foxp3表達明顯強于小細胞肺癌，進一步比較發(fā)現(xiàn)腺癌組織中Foxp3表達又強于鱗癌組織，見圖1。

提取正常肺組織、肺腺癌組織及肺鱗癌組織中Foxp3蛋白，使用Western-blot法分析它們之間的差異，結(jié)果顯示，與免疫組化結(jié)果相同，肺腺癌組織中Foxp3蛋白水平最高，明顯高于正常肺組織及鱗癌組織(P<0.05)；進一步分析肺腺癌不同分期組織中Foxp3蛋白水平，結(jié)果顯示分期越高肺腺癌組織中Foxp3蛋白水平也越高(P<0.05)，圖2。

圖1腺癌(不同分期)和鱗癌組織中Foxp3蛋白表達情況

三、血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)

流式細胞儀法檢測血清中表達Foxp3的CD4+CD25+Treg細胞的比例，肺腺癌Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者顯著高于健康人群和Ⅰ期患者(P<0.01)，肺腺癌Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者之間差異顯著(P<0.01)，Ⅰ期患者和健康人群之間無顯著差異(P>0.05)。手術(shù)前后改變值比較，Ⅰ期患者與Ⅱ期患者之間差異顯著(P<0.05)，化療前后改變值比較，ⅢB期患者與Ⅳ期患者之間無顯著差異(P>0.05)，見表2、3，圖3、4。

表2　肺腺癌患者及健康人群CD4+CD25+Treg細胞比例

表3　肺腺癌患者化療/手術(shù)后CD4+CD25+Treg細胞比例變化情況

圖2不同類型肺癌組織中Foxp3表達情況

圖3腺癌(不同分期)CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)

圖4肺腺癌患者化療/手術(shù)后CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)變化

四、CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)水平及化療后變化與患者生存周期分析

根據(jù)前面所述方法，通過隨訪觀察患者(ⅢB/Ⅳ期)生存時間，我們通過Kaplan-Meier生存曲線法繪制了不同CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)水平及化療后變化的情況和患者生存周期曲線，細胞計數(shù)水平高于平均值的32例患者平均生存周期為12.7±4.2月，細胞計數(shù)低于平均值的26例患者平均生存周期為16.9±3.7月(P<0.01)。經(jīng)化療后，細胞計數(shù)變化情況大于平均值的28例患者平均生存周期為16.4±4.5月，變化小于平均值的30例患者平均生存周期為13.5±3.6月(P<0.05)。我們進一步比較發(fā)現(xiàn)基數(shù)值低于平均值且化療后細胞計數(shù)變化值高于平均值的13例患者平均生存周期為18.6±3.9月，遠遠高于基數(shù)值。高于平均值且化療后細胞計數(shù)變化值小于平均值的16例患者平均生存周期為10.4±2.2月(P<0.05，表4，圖5)。

表4　不同細胞計數(shù)水平及化療后變化水平的患者生存時間(月)

圖5不同CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)及化療后變化與患者生存曲線；注：A：細胞計數(shù)低于平均值；B細胞計數(shù)高于平均值；C：細胞計數(shù)減少值高于平均值；D細胞計數(shù)減少值低于平均值；E：細胞計數(shù)基數(shù)值低于平均值且化療后變化值高于平均值；F細胞計數(shù)基礎值高于平均值且化療后變化值低于平均值

討　　論

肺癌目前已經(jīng)成為癌癥的首要致死原因，其中肺腺癌無論在男性還是女性患者中都占有相當大比例。目前針對肺腺癌的主要治療方案仍然是放化療，雖然近幾年來肺腺癌在靶向治療方面取得了較大的進展，但是隨著耐藥的增加，尋找更有效的治療手段或新的治療靶點已經(jīng)成為當前的研究熱點[6-7]。正常情況下人體內(nèi)的免疫穩(wěn)態(tài)是由CD4+CD25+Treg 細胞維持的，它們能影響免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的應答，從而有效的免疫監(jiān)視限制和清除腫瘤細胞。一些學者發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌患者中該細胞的計數(shù)也明顯升高，這為研究肺癌治療提供了思路[8-10]。

本研究結(jié)果表明Foxp3無論是在鱗癌組織還是腺癌組織中表達水平都明顯高于正常組織，進一步比較分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中Foxp3水平又明顯高于鱗癌組織，而且肺腺癌患者血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)明顯高于健康人群，且與腫瘤分期呈正相關。手術(shù)或化療能可能是通過使肺腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量下降從而起到治療作用。CD4+CD25+Treg細胞數(shù)增多、功能增強導致腫瘤免疫耐受的形成并降低了免疫系統(tǒng)對肺癌細胞的免疫應答，最終促進了肺癌的發(fā)生和發(fā)展，這可能是肺腺癌患者的發(fā)病機制之一[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細胞是由Foxp3誘導發(fā)育的，能夠特異性地表達Foxp3 ，其可以做為衡量人體中CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量多少的一個重要指標[14-15]。本研究結(jié)果提示外周血中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)或Foxp3水平可作為肺腺癌診斷的一個非特異性指標之一。

生存分析結(jié)果顯示肺腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)與患者生存周期之間有相關性，二者關系密切，且明顯呈負相關。而且經(jīng)化療后外周血中細胞計數(shù)變化不明顯也意味著預后較差即生存周期較短。反之如果治療措施能夠有效的減少患者外周血清中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)，患者生存周期則明顯改善。這提示可將患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞計數(shù)作為常規(guī)檢查并作為預測患者預后的指標之一，以利于及時調(diào)整治療方案及措施，達到改善患者預后的目的。

總之Foxp3調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，對其深入研究將有助于肺腺癌的早期診斷，可考慮將其作為常規(guī)檢查及監(jiān)測患者預后的指標之一，這也為肺腺癌患者治療提供了新的思路。

參考文獻

1錢桂生. 為提高我國呼吸系統(tǒng)疾病的診治水平而努力[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2012, 5(1): 1-3.

2Bao P, Zhao W, Li Y, et al. Protective effects of ulinastatin in patients with non-small cell lung Cancer after radiation therapy[J]. Med Oncol, 2015, 32(1): 405.

3Tan W, Zhang W, Strasner A, et al. Tumour-infiltrating regulatory T cells stimulate mammary cancermetastasis through RANKL-RANK signaling [J]. Nature, 2011, 470(7335): 548-553.

4張肖肖, 畢大鵬. 非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移放化療聯(lián)合的療效觀察[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(3)：562-563.

5保鵬濤, 趙衛(wèi)國, 李蕓, 等. 烏司他丁對NSCLC患者放療后血清中細胞因子的影響[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19 (10): 1868-1870.

6Tao H, Mimura Y, Aoe K, et al. Prognostic potential of FOXP3 expression in non-small cell lung cancer cells combined with tumor-infiltrating regulatory T cells [J]. Lung Cancer, 2012, 75(1): 95-101.

7Noh MS, Jun BH, Kim S, et al. Myung-Haing ChoMagnetic surface-enhanced Raman spectroscopic (M-SERS) dots for the identification of bronchialveolar stem cells in normal and lung cancer mice[J]. Biomaterials, 2009, 30(23-24): 3915-3925.

8劉慧, 李永懷, 桂淑玉. 肺癌患者血清腫瘤標記物檢測的臨床意義及預后評估[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19(12): 2219-2223.

9Katoh H, Zheng P, Liu Y . Signaling through FOXP3 as an X-linked tumor suppressor[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(11): 1784-1787.

10林稱意. 肺泡灌洗液和血清中腫瘤標志物檢測在肺癌診斷中的價值[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19 (4): 712-714.

11Bolzer K, K?ser T, Saalmüller A, et al. Molecular characterization of porcine Forkhead-box p3 (Foxp3)[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 132(2-4): 275-281.

12劉妍麗, 陸蘭英, 韓丹. 肺炎型肺癌的危險因素分析[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19(8)： 1485.

13Maruyama T, Konkel JE, Zamarron BF, et al. The molecular mechanisms of Foxp3 gene regulation[J]. Semin Immunol, 2011, 23(6): 418-423.

14許文景, 朱慕云, 黃冬云, 等. 腫瘤基因檢測指導下個體化化療應用于晚期非小細胞肺癌的臨床觀察[J]. 臨床肺科雜志, 2013, 18 (3)： 405.

15洪成雨, 鄭建, 李婷. 兩組化療方案治療NSCLC臨床療效觀察[J]. 臨床肺科雜志 ，2014， 19 (6)：1069-1071.

(本文編輯：王亞南)

保鵬濤，趙衛(wèi)國，馮金棟，等. Foxp3及其調(diào)控的CD4+CD25+Treg細胞在肺腺癌患者中表達的規(guī)律及對患者生存的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 301-305.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.015

通訊作者：趙衛(wèi)國，Email：zhaowg309@163.com

中圖法分類號：R734.2

文獻標識碼：A

Corresponding author：Zhao WeiGuo, Email：zhaowg309@163.com

(收稿日期：2015-06-23)

Expression of Foxp3 and CD4+CD25+Treg cells in lung adenocarcinoma patients and the survival analysis of patients affected by them

BaoPengtao,ZhaoWeiguo,FengJindong,LiuYu,LiYun,TangLiping.ChinesePeople′sLiberationArmyNo309Hospital,Beijing100091,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the expression of Foxp3 and CD4+CD25+Treg cells in lung adenocarcinoma patients and the survival analysis of patients affected by them. MethodsWestern-blot was used to detect the levels of Foxp3 in normal lung tissues, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma (Ⅱ,Ⅰ,Ⅲa staging). Expression of Foxp3 protein in small cell lung cancer, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma was observed by immunohistochemistry. CD4+CD25+Treg cells counted by Flow cytometry method. Using Kaplan-Meier survival curves to analyze the relationship between serum CD4+CD25+Treg cells count and lung adenocarcinoma patients. Resultslung adenocarcinoma patients with Foxp3 expression level in serum and count of CD4+ CD25+ Treg cells were significantly higher than those in healthy people, was positively correlated with tumor stage, cell count decreased significantly after surgery or chemotherapy intervention in patients. Cell count lower than the average value or chemotherapy after cell counting change value higher than the average value of patients′mean survival time was more than that the cell count higher than average or chemotherapy after cell counting change value less than the average value of patients. ConclusionFoxp3 and regulatory CD4+CD25+Treg cells may be one of the pathogenesis of lung adenocarcinoma, CD4+CD25+Treg cell counts could be a routine examination and as a forecast index of prognosis for adenocarcinoma patients.

【Key words】Adenocarcinoma;Foxp3;CD4+CD25+Treg cells;Survival analysis