崔金霞　關(guān)巍　黃琴　馮恩志　馮喜英　時(shí)瑩慶　拉周

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低壓低氧環(huán)境對(duì)肺氣腫大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

崔金霞1關(guān)巍1黃琴2馮恩志3馮喜英1時(shí)瑩慶1拉周1

810001 西寧，青海大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科1

【摘要】目的探討低壓低氧對(duì)肺氣腫大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響。方法選擇40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為中海拔( 海拔2 260 m)空白對(duì)照組、鹽水組、肺氣腫組及高海拔(低壓氧艙模擬海拔5 000 m)鹽水組、肺氣腫組，每組8只。鹽水組及肺氣腫組分別腹腔內(nèi)注射0.8 ml鹽水及香煙煙霧提取物(CSE)，每周一次，連續(xù)四周。第32天活殺小鼠取締組織肺組織病理切片蘇木素-伊紅染色(HE)后，測定不同海拔高度大鼠的平均內(nèi)襯間隔(MLI)、肺泡破壞指數(shù)(DI)、單個(gè)肺泡面積(APA)及單位面積肺泡數(shù)(DPA)。結(jié)果4周后中、高海拔肺氣腫組大鼠肺組織呈現(xiàn)肺氣腫病理改變。高海拔肺氣腫組MLI[(226.61±27.51)μm]、DI[(73.98±6.97)%]、APA[(10 606.83±923.05) μm2]明顯高于中海拔肺氣腫組，DPA[(88.84±5.67)/mm2]明顯低于中海拔肺氣腫組(均P<0.05)；高海拔鹽水組MLI[(193.13±24.66) μm]、DI[(57.64±6.72)%]、APA[(5 399.42±1 058.47) μm2]明顯高于中海拔鹽水組，DPA[(182.11±39.79)/mm2]明顯低于中海拔鹽水組(均P<0.05)。結(jié)論低壓低氧環(huán)境可加重肺氣腫大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的破壞。

【關(guān)鍵詞】肺氣腫；低壓低氧；香煙煙霧提取物；肺組織結(jié)構(gòu)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。高原環(huán)境低壓、低氧，呼吸系統(tǒng)是開放的系統(tǒng)，很容易受到高原環(huán)境的影響。有研究顯示，COPD發(fā)病率與海拔高度呈負(fù)相關(guān)，但病死率隨海拔升高而增加[1-3]，但也有與此相反的研究結(jié)果[5-6]。肺氣腫是COPD主要的病理類型，本實(shí)驗(yàn)通過在不同海拔建立肺氣腫大鼠模型觀察高原低壓低氧對(duì)肺氣腫大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響。

材料與方法

一、試劑及儀器

萬寶路香煙(焦油量8 mg，煙堿量0.8 mg)；磷酸鹽緩沖鹽水；0.9%生理鹽水若干瓶；蘇木素液；醇溶性伊紅；4%多聚甲醛；二甲苯；無水酒精；95%酒精 85%酒精；75%酒精；0.5%鹽酸；中性樹膠；Tissue-Tek, PS-53 肺組織切片機(jī) (Sakura Company, Tokyo, Japan)；OLYMPUS BX53 光學(xué)顯微鏡(Olympus CO, Ltd, Tokyo, Japan)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組： 健康清潔雄性Wistar大鼠40只(蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購買，合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001)，體質(zhì)量(143±6.6)g，鼠齡6周，購買當(dāng)日運(yùn)回青海西寧。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為：中海拔(2 260 m)空白對(duì)照組、鹽水組、肺氣腫組和高海拔鹽水組、肺氣腫組。高海拔鹽水組和肺氣腫組大鼠飼養(yǎng)于低壓氧艙內(nèi)，模擬到海拔5 000 m(壓力：52 889～53 001 Pa，氧分壓：42 mmHg，新風(fēng)量：110～189 m3/h，溫度：16.9～24 ℃，濕度：37.3%～51% )，連續(xù)24 h(打掃、清潔、喂食及注射藥物均在低氧環(huán)境下進(jìn)行)。各試驗(yàn)組大鼠按晝夜節(jié)律采光12 h，通風(fēng)良好，保持室溫條件，定期消毒，自由攝食、飲水。

2. 肺氣腫模型建立: 香煙提取物(cigarette smoke extraction, CSE)的制備按照文獻(xiàn)[3-4]的方法進(jìn)行改進(jìn)，將60 ml一次性注射器鏈接三通管后，在三通管一側(cè)鏈接膠管，用以鏈接香煙過濾嘴，另一側(cè)鏈接針頭后，插入橡膠瓶塞進(jìn)入瓶中。點(diǎn)燃香煙后，每次吸60 ml，每次抽吸時(shí)間持續(xù)5 s,共抽吸12次，共720 ml煙霧，將香煙煙霧緩慢注入500 ml干凈的蒸餾水玻璃瓶中，連續(xù)抽吸直至香煙燃至過濾嘴前方1 cm處停止抽吸。搖晃含有香煙煙霧及緩沖液的玻璃瓶約10 min，使香煙煙霧完全溶解于緩沖液中，完成CSE溶液的配置。CSE溶液每次使用前新鮮配置。中、高海拔鹽水組和肺氣腫組分別腹腔內(nèi)注射0.8 ml 0.9%生理鹽水及0.8 ml CSE，每周1次，連續(xù)4周。于第32天腹腔麻醉下開胸，通過自制灌注固定裝置沖洗肺臟至肺葉變白、雙肺膨脹、邊緣變鈍，胸膜展開后摘取肺臟，迅速放入4%甲醛溶液的避光盒中。

3. 肺組織病理切片形態(tài)定量分析: 平均內(nèi)襯間隔(mean linear intercept, MLI)：肺組織經(jīng)過常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度均為3.5 μm，每只大鼠右肺取3張切片，行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。后，在Mshot Digital Imaging System V1.0軟件系統(tǒng)下，光學(xué)顯微鏡(10×10)同一倍數(shù)下觀察切片。每個(gè)切片隨機(jī)讀取3個(gè)視野，避開大血管及大支氣管，每個(gè)視野中心劃十字交叉線，計(jì)算總十字線長度(L)及與十字線交叉的肺泡隔數(shù)(NS)，利用公式MLI=L/NS，表示肺泡內(nèi)徑的平均值。

肺泡破壞指數(shù)(destructive index, DI)：在同上系統(tǒng)軟件低倍鏡下，每張切片觀察20個(gè)非重復(fù)視野，若視野中除了肺泡以外的任意一結(jié)構(gòu)直徑大于0.59 mm，此視野不計(jì)數(shù)。在每個(gè)切片中心劃十字交叉線，計(jì)數(shù)十字線四個(gè)區(qū)域的肺泡數(shù)，分別用正常(N)及破壞(D)記錄，再求和。劃十字交叉線的目的主要是防止少數(shù)或多數(shù)現(xiàn)象。如果肺泡囊或腔只有一個(gè)開口或沒有開口時(shí)，記為N。當(dāng)一個(gè)肺泡囊或腔有2個(gè)或2個(gè)以上的開口時(shí)，記為D；當(dāng)肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)或以上的中斷的肺泡壁組織時(shí)，記為D；當(dāng)肺泡壁被覆了很明顯的非正常組織(立方上皮)而增厚時(shí)，記為D；當(dāng)呈明顯肺氣腫損害時(shí)記為D。以公式DI=D/(D+N)。病理讀片均采用雙盲法。

單個(gè)肺泡面積(area of pulmonary alveoli, APA)、單位面積肺泡數(shù)(density of pulmonary alveoli, DPA)：采用江蘇省捷達(dá)科技8.0軟件系統(tǒng)，每只大鼠取1張片子，每張片子讀取8個(gè)非重復(fù)視野，均采用圖像分析系統(tǒng)直接得出。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)　　果

一、 肉眼及光學(xué)顯微鏡大鼠肺組織的病理變化

肉眼及光學(xué)顯微鏡大鼠肺組織的病理變化，見表1、圖1。

二、各組間大鼠MLI、DI、APA、DAP的比較

5組之間的MLI、DI、APA、DAP比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中海拔肺氣腫組MLI、DI、APA高于中海拔空白對(duì)照組及中海拔鹽水組，DAP低于中海拔空白對(duì)照組及中海拔鹽水組(均P<0.05)；高海拔鹽水組MLI、DI、APA高于中海拔空白對(duì)照組及中海拔鹽水組，DAP低于中海拔空白對(duì)照組及中海拔鹽水組(均P<0.05)；高海拔肺氣腫組MLI、DI、APA高于中海拔空白對(duì)照組、中海拔肺氣腫組及高海拔K組，DAP低于中海拔空白對(duì)照組、中海拔肺氣腫組及高海拔鹽水組(均P<0.05)， 見表2。

表1　肉眼及光學(xué)顯微鏡下大鼠肺組織病理變化

表2　各組大鼠肺組織的MLI、DI、DAP、APA的比較

注：與中海拔空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與中海拔鹽水組比較，bP<0.05；與中海拔肺氣腫組比較，cP<0.05； 與高海拔鹽水組比較，dP<0.05；MLI: 平均內(nèi)襯間隔;DI：肺泡破壞指數(shù);DAP: 單位面積肺泡數(shù);APA: 單個(gè)肺泡面積

圖1光學(xué)顯微鏡大鼠肺組織的病理變化。注：A：正常空白對(duì)照組HE×40；B：中海拔生理鹽水組HE×40；C：中海拔肺氣腫組HE×40；D：高海拔鹽水組HE×40；E：高海拔肺氣腫組 HE×40

討　　論

低壓、低氧是高原環(huán)境最主要的兩個(gè)特點(diǎn)，人體處于高原環(huán)境下，多系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，而疾病受到高原環(huán)境的影響，也可能具有與平原不同的特點(diǎn)。高原環(huán)境下COPD肺組織的結(jié)構(gòu)變化如何，目前很少有研究涉及。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，無論是急性還是慢性低氧狀態(tài)下肺組織結(jié)構(gòu)均有可能發(fā)生改變。張春愛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠3 d到達(dá)海拔4 500 m地區(qū)，光鏡下肺泡隔增寬，肺間質(zhì)疏松，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血明顯，某些區(qū)域內(nèi)可見肺泡腔內(nèi)有粉紅色滲出物。李福祥等[7-8]在低壓氧艙模擬海拔6 000 m 1 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織也具有同樣的改變。但大鼠在海拔4 500 m停留30 d后，間質(zhì)性肺水腫明顯減輕，肺泡腔清晰，肺泡隔結(jié)構(gòu)基本正常，部分區(qū)域可見肺間質(zhì)增生及輕度肺氣腫改變。本研究結(jié)果顯示，與中海拔鹽水組比較，高海拔鹽水組大鼠肺組織肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁變薄、DAP減少、DI增加，說明長期慢性低壓低氧環(huán)境下，肺組織破壞增加，有肺氣腫改變趨勢。

目前認(rèn)為吸煙是發(fā)生COPD的最危險(xiǎn)因素之一。本研究利用腹腔注射香煙提取物成功建立了肺氣腫模型。并且觀察到海拔5 000 m的大鼠肺氣腫模型組與海拔2 260 m相比，大鼠肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁變薄、肺泡破裂明顯，并且MLI、DI及APA明顯大于低海拔組，DAP明顯小于海拔2 260 m肺氣腫模型組,說明高海拔肺氣腫大鼠肺泡破壞增加，正常的肺泡數(shù)量減少。

本研究還顯示，在同一海拔條件下，肺氣腫大鼠與單純低壓、低氧的大鼠相比，肺組織的破壞更重，說明在香煙及低壓、低氧雙重因素的作用下，肺氣腫的肺組織損害加重。

COPD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為主要與細(xì)胞凋亡、蛋白酶失衡、氧化/抗氧化失衡學(xué)說及全身炎性效應(yīng)有關(guān)。有研究顯示持續(xù)的低壓、低氧環(huán)境下，大鼠肺組織細(xì)胞Caspase-3表達(dá)降低，返回平原后，表達(dá)增加。進(jìn)駐高原人群血中TNF-α和IL-6水平也明顯高于平原人群[9-10]。有研究顯示低氧時(shí)增加NF-κB的活化程度，巨噬細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性增加，可導(dǎo)致TNF-α和IL-6分泌增加[11-12]。NF-κB的p50和p65亞單位可結(jié)合于HIF-1α的κB結(jié)合點(diǎn)，低氧時(shí)這些亞單位過表達(dá)可導(dǎo)致HIF-1α mRNA表達(dá)增加，而HIF-1α又可以反過來調(diào)節(jié)NF-κB[13-14]。還有研究顯示慢性持續(xù)低氧大鼠肺組織超氧化物歧化酶、丙二醛、NADPH氧化酶2、4的濃度明顯增加[15-16]。由此可見，低壓、低氧影響肺組織細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞因子的變化及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而加重肺氣腫大鼠肺組織的損傷，其確切機(jī)制尚有待深入研究。

綜上所述，低壓、低氧加重了肺氣腫大鼠肺組織的損傷，高原肺氣腫患者在疾病和高原環(huán)境雙重?fù)p傷下病情更重，因此，有必要對(duì)高原肺氣腫患者的防治制定有效措施，從而提高高原患者的生存質(zhì)量。

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(本文編輯：黃紅稷)

崔金霞，關(guān)巍，黃琴，等. 低壓低氧環(huán)境對(duì)肺氣腫大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 282-285.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.011

基金項(xiàng)目：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011-Z-710)

通訊作者：關(guān)巍，Email：weiguan110@163.com

中圖法分類號(hào)：R563.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Corresponding author：Guan Wei, Email: weiguan110@163.com

(收稿日期：2016-03-21)

Influence of hypobaric hypoxia on the lung tissue structure in rats with emphysema

CuiJinxia1,GuanWei1,HuangQin2,FengEnzhi3,FengXiying1,ShiYingqing1,LaZhou1.1Desect1mentofRespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining, 810001,China;2Desect1mentofRespiratoryMedicine,SantaiPeople′sHospital,MianyangCity,SichuanProvince,Mianyang, 621100,China;3Desect1mentofRespiratoryMedicine,theForthhospitalofChinesePeople′sLiberationArmy,Xining, 810007,China

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of different altitude on rat′s pulmonary emphysema formation, it was measured that relative indices, including mean linear intercept (MLI), destructive index (DI), area of pulmonary alveoli (APA) and density of pulmonary alveoli (DPA). MethodsA total of 40 male wistar rats were randomly divided into five groups: blank control group, saline group and, emphysema group in moderate altitude(2 260 m); saline group and, emphysema group at high altitude(hypobaric chamber, 5 000 m), with 8 eats in each group. Emphysema and saline groups were respectively injected cigarette smoke extraction (CSE) and saline intraperitoneally once a week for four weeks. After HE stanning, MLI and DI were measured in lung tissues to assess the degree of emphysema. It was measured that APA and DPA by stereological methods. ResultsThe MLI, DI and APA were significantly higer, the DAP was significantly lower in the emphysema group rats than compared with control group rats (all P<0.05 ). The velues of MLI[(226.61±27.51) μm], DI[(73.98±6.97)%], APA[(10 606.83±923.05) μm2] were significantly higher, DPA[(88.84±5.67)/mm2] was lower in emphysema group rats at high altitude than those of emphysema group rats at moderate altitude (all P<0.05). The values of MLI[(193.13±24.66) μm], DI[(57.64±6.72)%], APA[(5 399.42±1 058.47) μm2] were significantly higher, DPA[(182.11±39.79)/mm2] was lower in saline group rats at high altitude than those of saline group rats at moderate altitude(all P<0.05). ConclusionThe hypobaric hypoxia of high altitude environment aggravates the damage of the lung architecture in rats with emphysema.

【Key words】Pulmonary emphysema;Hypobaric hypoxia;Cigarette smoke extract;Lung architecture

621100 四川，四川綿陽市三臺(tái)縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科2

810007 西寧，中國人民解放軍第四醫(yī)院呼吸內(nèi)科3