劉經(jīng)緯 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 周慧慧 艾慶輝

（中國(guó)海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 266003）

谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)非特異性免疫相關(guān)酶活力和低氧應(yīng)激后HIF-1α表達(dá)的影響

劉經(jīng)緯 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 周慧慧 艾慶輝

（中國(guó)海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 266003）

為探討飼料中谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)非特異性免疫以及低氧應(yīng)激后HIF-1α表達(dá)的影響， 實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了4種谷氨酰胺添加量分別為0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微顆粒飼料（游離谷氨酰胺測(cè)定值分別為0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%）， 飼喂35日齡半滑舌鰨稚魚(yú)［平均干重（10.64±0.86） mg］。每天飽食投喂5次，養(yǎng)殖周期30d， 養(yǎng)殖結(jié)束后進(jìn)行低氧應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明， 谷氨酰胺添加量為0.5%時(shí)半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體溶菌酶（LZM）活力顯著高于未添加組（P＜0.05）。飼料中不同谷氨酰胺水平對(duì)魚(yú)體總一氧化氮合酶（TNOS）活力和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活力沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)克隆了半滑舌鰨低氧應(yīng)激關(guān)鍵基因——缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF-1α）， 得到749 bp半滑舌鰨HIF-1α核心序列， 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明半滑舌鰨HIF-1α氨基酸序列與大部分魚(yú)類(lèi)具有較高同源性。定量PCR結(jié)果顯示， 飼料中谷氨酰胺水平對(duì)低氧應(yīng)激后半滑舌鰨稚魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)HIF-1α表達(dá)量未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。綜上所述， 在飼料中添加谷氨酰胺能夠顯著增強(qiáng)半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體溶菌酶活力（P＜0.05）， 提高非特異性免疫水平。

谷氨酰胺； 半滑舌鰨； 仔稚魚(yú)； 非特異性免疫； HIF-1α； 基因克隆及定量

“條件必需氨基酸”谷氨酰胺（Glutamine）是機(jī)體內(nèi)含量豐富的一種氨基酸， 在供能、蛋白質(zhì)和核苷酸合成、免疫以及抗氧化等生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要的功能［1—5］。有關(guān)谷氨酰胺對(duì)哺乳動(dòng)物免疫作用的研究較為深入， 近年來(lái)， 谷氨酰胺在魚(yú)類(lèi)免疫中的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)之一。仔稚魚(yú)階段的主要免疫方式為非特異性免疫［6］。溶菌酶是非特異性免疫防御中重要的組成部分， 其活力可以從一定程度上反映機(jī)體非特異性免疫水平［7］。此外， 一氧化氮（NO）作為一種由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的分子， 除了參與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號(hào)調(diào)節(jié)以外， 還在抵御病原菌方面發(fā)揮著重要的免疫功能［8］。在美國(guó)紅魚(yú)（Sciaenops ocellatus）、雜交鱘（Acipenser schrenckii × Huso dauricus）和建鯉（Cyprinus carpio var. Jian）幼魚(yú)中的研究發(fā)現(xiàn)， 在飼料中添加適量谷氨酰胺能夠增強(qiáng)頭腎巨噬細(xì)胞溶菌酶活力， 提高血清C3和 C4補(bǔ)體水平， 調(diào)節(jié)頭腎和脾臟中細(xì)胞因子的基因表達(dá)［9—11］。但是有關(guān)谷氨酰胺對(duì)仔稚魚(yú)非特異性免疫功能影響的研究還十分缺乏， 且作用機(jī)理并不明確。

低氧應(yīng)激是仔稚魚(yú)工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中的潛在威脅之一， 適宜的營(yíng)養(yǎng)狀況有助于維持魚(yú)體健康，增強(qiáng)免疫水平并提高機(jī)體抗應(yīng)激能力［12］。缺氧誘導(dǎo)因子1 （HIF-1）是由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子， 在低氧應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制中起著核心作用， 可以通過(guò)控制相關(guān)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖運(yùn)輸、糖酵解和血紅細(xì)胞生成等生理過(guò)程從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)低氧的耐受性［13， 14］。HIF-1由α和β兩個(gè)亞基組成， HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)， 不受細(xì)胞氧濃度的調(diào)節(jié)，HIF-1α在低氧條件下大量表達(dá)， 是HIF-1的活性亞基［15］。相較于哺乳動(dòng)物而言， 魚(yú)類(lèi)HIF-1的研究十分有限， 有關(guān)飼料中谷氨酰胺對(duì)魚(yú)類(lèi)HIF-1α表達(dá)的影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是我國(guó)海水養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)， 由于其肉質(zhì)細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富， 野生資源十分缺乏， 因而具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是半滑舌鰨仔稚魚(yú)階段， 由于免疫系統(tǒng)發(fā)育并不完善、抗應(yīng)激能力較弱， 因而死亡率較高。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在飼料中添加不同水平的谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)非特異性免疫相關(guān)酶活力以及低氧應(yīng)激后HIF-1α mRNA表達(dá)影響， 闡明谷氨酰胺在魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)免疫中的作用機(jī)制， 為提高半滑舌鰨仔稚魚(yú)成活率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)飼料配方以劉峰等［16］對(duì)半滑舌鰨微顆粒飼料開(kāi)發(fā)的研究結(jié)果為基礎(chǔ)并改進(jìn)而成。以低溫白魚(yú)粉、磷蝦粉、肉骨粉、魷魚(yú)粉和魚(yú)肉水解蛋白作為主要蛋白源， 魚(yú)油和大豆卵磷脂作為脂肪源，分別添加0、0.5%、1.0%和2.0%的谷氨酰胺， 并用甘氨酸調(diào)節(jié)總蛋白水平保持一致， 配制成4種等氮等脂的飼料。谷氨酰胺購(gòu)自青島福林生物技術(shù)有限公司（中國(guó)青島）， 純度≥99%（表 1）。實(shí)驗(yàn)飼料的制作采用微黏合技術(shù)， 將所有原料經(jīng)超微粉碎后充分混勻， 混勻的過(guò)程中搓入水、魚(yú)油和大豆卵磷脂，隨后制成顆粒飼料并恒溫干燥， 最后將所得的顆粒飼料再破碎后過(guò)篩， 得到適宜粒徑的實(shí)驗(yàn)飼料， 并儲(chǔ)存在-20℃冰箱中備用， 以防止脂質(zhì)過(guò)氧化。

表 1 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成（% 干物質(zhì)）Tab. 1 Formulation and proximate analysis of the experimental diets （% dry matter）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與養(yǎng)殖條件

實(shí)驗(yàn)在山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司進(jìn)行，所用魚(yú)苗為該場(chǎng)人工繁殖的35日齡半滑舌鰨稚魚(yú)［平均干重（10.64±0.86） mg］。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)桶內(nèi)魚(yú)苗150尾（養(yǎng)殖桶規(guī)格為65 cm×65 cm× 90 cm， 水容積約200 L）。養(yǎng)殖期間， 采用循環(huán)水系統(tǒng)， 水溫25—26℃， pH 7.8—8.0， 鹽度29‰—30‰，氨氮含量≤0.19 mg/L。每天飽食投喂5次（6：00，9：00， 14：00， 18：00和21：00）， 養(yǎng)殖周期30d。

1.3 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

在30d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)， 從每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)撈取8尾半滑舌鰨稚魚(yú)， 放入裝滿(mǎn)海水的600 mL密封絲扣瓶中。當(dāng)50%稚魚(yú)死亡時(shí)， 將其余存活的稚魚(yú)在冰面上解剖出內(nèi)臟團(tuán)并用1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管收集， 迅速放入液氮中， 隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲(chǔ)存以備隨后進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.4 取樣與解剖

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 停食24h以充分排空腸道內(nèi)容物后取樣， 全部魚(yú)苗用2 mL和5 mL離心管液氮冷凍隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲(chǔ)存保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行酶活力分析時(shí)， 將半滑舌鰨稚魚(yú)全魚(yú)稱(chēng)重后， 用0℃的生理鹽水（pH 7.4）勻漿， 全魚(yú)組織（g）和生理鹽水（mL）的比例為1∶9。隨后全魚(yú)勻漿在3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min， 收集離心后的勻漿上清液， 用于隨后的分析。

1.5 分析方法

非特異性免疫相關(guān)酶活力分析 半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體溶菌酶（LZM）檢測(cè)方法（濁度比色法）參考Ellis［17］的方法； 以磷酸緩沖液（pH， 6.1）配制微壁溶球菌（Micrococcus lysodeikticus， Sigma， USA）懸液作反應(yīng)底物， 組織勻漿與菌懸液按1∶19混合，25℃水浴反應(yīng)10min后， 測(cè)定530 nm波長(zhǎng)下一段時(shí)間內(nèi)吸光值的變化， 每隔 1min 讀數(shù)一次。LZM活力的測(cè)定結(jié)果表示為U/mg·protein， 每個(gè)活力單位（U）定義為每毫克可溶蛋白每分鐘使吸光值降低0.001的倍數(shù)。

一氧化氮合酶（NOS）測(cè)定操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)（南京建成生物工程研究所， 中國(guó)南京）。測(cè)定原理根據(jù)NOS可催化L-Arg和分子反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物， 在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度， 根據(jù)吸光度大小可計(jì)算出NOS活力。NOS主要有兩種類(lèi)型——結(jié)構(gòu)型（cNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。cNOS主要存在于神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)， 依賴(lài)鈣； iNOS主要存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)， 不依賴(lài)鈣。根據(jù)此原理可以測(cè)定分型。NOS活力測(cè)定結(jié)果表示為U/mg·protein， 將每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白濃度的測(cè)定參照Bradford［18］的方法， 用牛血清蛋白（BSA，A-2153，Sigma， USA）作底物。

RNA提取、cDNA合成和缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF-1α）核心片段的克隆 半滑舌鰨內(nèi)臟團(tuán)總RNA提取按照Trizol法， 并將提取RNA用DNase （TaKaRa， Japan）處理去除其中殘留DNA。利用NanoDrop ND-1000核酸分析儀（Wilmington， DE）測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度， 并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit （PerfectRealTime）（TaKaRa， Japan）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

參考許氏平鲉（Sebastes schlegelii）（GenBank No. KC918362.1）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）（GenBank No. DQ171936.2）、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）（GenBank No. AY735010.1）、細(xì)須石首魚(yú)（Micropogonias undulates）（GenBank No. DQ363931.1）、金頭鯛（Sparus aurata）（GenBank No. JQ308830.1）、川鰈（Platichthys flesus） （GenBank No. EF100709.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（GenBank No. NM_001124288.1）、大西洋鮭（Salmo salar）（GenBank No. BT059247.1）的HIF-1α核苷酸序列， 利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)HIF-1α的簡(jiǎn)并引物（表 2）。

表 2 本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列Tab. 2 Primers used in the current study

HIF-1α PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler gradient （Eppendorf， German）中進(jìn)行， 反應(yīng)程序設(shè)定： PCR 反應(yīng)程序設(shè)置依次為： 94℃ 3min （預(yù)變性， 1個(gè)循環(huán)）； 94℃ 30s （變性）， 58℃ 30s （退火），72℃ 1min （延伸）， 30次循環(huán)； 72℃ 10min （終延伸，1個(gè)循環(huán)）。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；目的片段產(chǎn)物經(jīng)EazyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒回收并連接到pEasy-T1載體（TransGen Biotech， China）； 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli TOP10中； 固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜； 經(jīng)菌落PCR后， 挑選4個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序， 在NCBI上BLAST比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

序列分析 用DNAMAN對(duì)HIF-1α克隆片段進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)， Clustal X 進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析后， 用MEGA4.0軟件的Neighbour-Joining法（1000 runs）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

HIF-1α實(shí)時(shí)熒光定量 根據(jù)克隆所得HIF-1α核心片段設(shè)計(jì)出特異性引物（表 2）， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參， 進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)體系為25 μL， 其中上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL， 模板cDNA 1 μL， 2×SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa， Japan） 12.5 μL和9.5 μL的無(wú)菌水。定量PCR的程序設(shè)定為95℃， 2min， 1個(gè)循環(huán)； 95℃， 10s，58.7℃ 10s， 72℃， 20s， 40個(gè)循環(huán)； 之后進(jìn)行熔解曲線以檢驗(yàn)每個(gè)PCR反應(yīng)只有1個(gè)PCR產(chǎn)物。通過(guò)制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致性檢驗(yàn)， 擴(kuò)增效率的計(jì)算公式E=10（-1/Slope）-1 （Slope為斜率）。在本實(shí)驗(yàn)中， HIF-1α和GAPDH的擴(kuò)增效率分別為0.9884和0.9494。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量［19］。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 在單因素方差分析（one-way ANOVA）達(dá)到顯著水平（P＜0.05）時(shí)， 采用Tukey's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較， 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 非特異性免疫相關(guān)酶活力

LZM活力 不同的谷氨酰胺添加水平顯著影響了半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體LZM活力（P＜0.05）。魚(yú)體LZM活力最高值出現(xiàn)在0.5%添加組， 顯著高于未添加組（P＜0.05）， 但與1.0%和2.0%添加組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05， 圖 1）。

圖 1 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)全魚(yú)溶菌酶活力的影響Fig. 1 Effects of dietary glutamine supplementation on activities of lysozyme in whole body of C. semilaevis post larvae

NOS活力 飼料中游離谷氨酰胺含量為0、0.5%、1.0% 和2.0%時(shí)， 半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體總一氧化氮合酶（TNOS）活力分別為1.06、1.81、1.09和1.54 U/mg·protein （圖 2）， iNOS活力分別為0.81、1.42、1.00和1.11 U/mg·protein （圖 3）。但是， 不同谷氨酰胺添加組半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體TNOS和iNOS活力均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖 2 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)全魚(yú)總一氧化氮合酶活力的影響Fig. 2 Effects of dietary glutamine supplementation on total activities of nitric oxide synthase in whole body of C. semilaevis post larvae

2.2 半滑舌鰨HIF-1α核心片段的克隆、序列分析及定量表達(dá)

HIF-1α核心片段的克隆和序列分析 片段克隆得到HIF-1α核心序列749 bp， 序列已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)， GenBank Accession No. KP723543。通過(guò)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨HIF-1α核苷酸序列與大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）（GenBank No. KM593915.1）相似性最高， 為94%； 與南極冰魚(yú)（Chaenocephalus aceratus）（GenBank No. GU362090.1）的相似度為90%； 與鰱（Hypophthalmichthys molitrix）（GenBank No. HM146310.1）的相似度為81%； 與齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax prenanti）（GenBank No. KJ679876.1）的相似度為77%； 與林蛙（Rana temporaia）（GenBank No. EU262663.1）相似度為77%。

圖 3 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)全魚(yú)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活力的影響Fig. 3 Effects of dietary glutamine supplementation on activities of inducible nitric oxide synthase in whole body of C. semilaevis post larvae

將克隆的HIF-1α部分核酸序列經(jīng)DNAMAN翻譯， 得到半滑舌鰨HIF-1α氨基酸序列片段（249個(gè)氨基酸）， BLASTP分析得到半滑舌鰨HIF-1α氨基酸片段與點(diǎn)帶石斑魚(yú)（GenBank No. AAW29027.1）的相似度最高， 為71%； 與短頭壯綿鳚（Pachycara brachycephalum） （GenBank No. AAZ52828.1）的相似度為70%； 與河鱸（Perca fluviatilis）（GenBank No. ABO26717.1）的相似度為69%； 金頭鯛（GenBank No. AFV39804.1）的相似度為68%， 與大西洋鮭（GenBank No. ACN10960.1）的相似度為61%； 與南極冰魚(yú)（GenBank No. ADC55888.1）的相似度為54%；與人（Homo sapiens）（GenBank No. NP_851397.1）的相似度為48%； 與山羊（Capra hircus）（GenBank No.AEW10558.1）、家兔（Oryctolagus cuniculus）（GenBank No. NP_001076251.1）的相似度為47%；與小鼠（Mus musculus）（GenBank No. AAC53455.1）的相似度為46%。

根據(jù)半滑舌鰨與其他9種脊椎動(dòng)物HIF-1α氨基酸序列構(gòu)建脊椎動(dòng)物NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)， 半滑舌鰨HIF-1α與大西洋鮭、點(diǎn)帶石斑魚(yú)和金頭鯛、河鱸等其他魚(yú)類(lèi)分聚一支； 人、山羊和小鼠等哺乳動(dòng)物分聚為一支， 禽類(lèi)聚為另一支（圖 4）。

圖 4 根據(jù)Neighbour-Joining法（1000 runs）構(gòu)建的HIF-1α氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 A phylogenetic tree constructed by Neighbour-joining method （1000 runs） for amino acid sequences of HIF-1α

低氧應(yīng)激后舌鰨內(nèi)臟團(tuán)HIF-1α的表達(dá)量

低氧應(yīng)激后各處理組半滑舌鰨內(nèi)臟團(tuán)HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量接近， 雖然在未添加組表達(dá)量較高， 但各處理組之間HIF-1α mRNA表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05， 圖 5）。

圖 5 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)低氧應(yīng)激后內(nèi)臟團(tuán)HIF-1α的影響Fig. 5 Effects of dietary glutamine supplementation on HIF-1α mRNA expression in visceral mass of post larval C. semilaevis

3 討論

3.1 谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)非特異性免疫相關(guān)酶活力的影響

營(yíng)養(yǎng)和免疫密切相關(guān)， 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)提高魚(yú)體抗病力已被證明是一種行之有效的方法［12］。已有研究結(jié)果顯示， 谷氨酰胺可以促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、改善腸道結(jié)構(gòu)， 并且在提高免疫力方面具有良好功效［9， 10， 20—23］。溶菌酶和補(bǔ)體等其他一些因子作為魚(yú)體非特異性免疫的組成部分， 對(duì)殺滅病原菌具有重要作用。Cheng等［9， 21］的研究結(jié)果表明飼料中添加谷氨酰胺能夠提高美國(guó)紅魚(yú)和雜交鱘（Morone chrysops × M. saxatilis）幼魚(yú)頭腎巨噬細(xì)胞中的溶菌酶活力； Zhu等［10］的研究得到類(lèi)似結(jié)論， 發(fā)現(xiàn)飼料中添加丙氨酰-谷氨酰胺二肽對(duì)雜交鱘（A. schrenckii× H. dauricus）幼魚(yú)血清溶菌酶活力具有促進(jìn)作用。在本實(shí)驗(yàn)中， 谷氨酰胺添加水平為0.5%時(shí)魚(yú)體溶菌酶活力顯著高于未添加組（P＜0.05）， 說(shuō)明谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)的非特異性免疫能力也具有一定的促進(jìn)作用， 與在幼魚(yú)中的研究結(jié)論一致。

iNOS可以在致炎因子的刺激下迅速表達(dá)并產(chǎn)生大量NO， 從而起到殺菌作用［8］。Wei等［24］的研究表明， iNOS基因突變小鼠對(duì)寄生蟲(chóng)（Leishmania major）的感染率較高， 由角叉藻引起的非特異性抗炎反應(yīng)降低。值得注意的是， NO雖然可以殺滅病原菌， 但是如果濃度過(guò)高、持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起DNA損傷， 線粒體呼吸抑制等［25］。谷氨酰胺對(duì)NO的合成起著重要的調(diào)控作用， 能夠劑量依賴(lài)性抑制精氨酸生成NO過(guò)程［26］。已有研究表明， 在斑點(diǎn)叉尾鮰巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中加入精氨酸和/或谷氨酰胺能夠促進(jìn)其產(chǎn)生NO［27］。本實(shí)驗(yàn)室先前在大菱鲆中的研究發(fā)現(xiàn)， 飼料中精氨酸和谷氨酰胺水平對(duì)大菱鲆幼魚(yú)血清和肝臟中的iNOS活力的影響存在顯著交互作用（P＜0.05）， 可以促進(jìn)或抑制iNOS活力［28］。然而，在本實(shí)驗(yàn)中， 飼料中谷氨酰胺水平對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體TNOS和iNOS活力均沒(méi)有顯著影響。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與先前研究結(jié)論不一致的原因， 可能與取樣時(shí)間點(diǎn)的差異有關(guān)。此外， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同，生長(zhǎng)階段、環(huán)境因子、生理狀態(tài)和代謝水平等也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

谷氨酰胺提高動(dòng)物非特異性免疫能力的作用機(jī)理在哺乳類(lèi)中的研究較為深入， 研究表明谷氨酰胺可以通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和激活巨噬細(xì)胞功能來(lái)增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的免疫力［29—32］， 但在魚(yú)類(lèi)中相關(guān)研究還十分有限。已有研究表明， 谷氨酰胺可以提高血清補(bǔ)體水平［10， 11］， 提高中性粒細(xì)胞氧化自由基產(chǎn)量、頭腎巨噬細(xì)胞胞內(nèi)和胞外超氧陰離子濃度［9］。在本實(shí)驗(yàn)中， 飼料中添加0.5%谷氨酰胺顯著增強(qiáng)了魚(yú)體LZM的活力， 推測(cè)谷氨酰胺對(duì)溶菌酶活力的提升作用機(jī)制可能與在哺乳動(dòng)物中相似， 與促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子有關(guān)［10］。脾臟是魚(yú)類(lèi)重要的免疫器官， Hu等［11］研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加谷氨酰胺后上調(diào)了建鯉幼魚(yú)脾臟中TOR的磷酸化水平， 提高了脾臟蛋白質(zhì)含量。谷氨酰胺對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫作用研究的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

3.2 半滑舌鰨HIF-1α基因克隆以及谷氨酰胺對(duì)半滑舌鰨稚魚(yú)低氧應(yīng)激后HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

低氧應(yīng)激所引起的相關(guān)基因表達(dá)的變化是魚(yú)體適應(yīng)低氧環(huán)境的重要途徑。常氧條件下， HIF-1α在翻譯后即被泛素-蛋白酶水解復(fù)合體降解， 在缺氧條件下HIF-1α降解被抑制并與HIF-1β結(jié)合形成二聚體HIF-1， HIF-1可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄［15］。Soitamo等［33］在虹鱒中第一次克隆到魚(yú)類(lèi)的HIF-1α基因序列， 隨后其他學(xué)者陸續(xù)在虹鱒、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）、波紋絨須石首魚(yú)（Micropogonias undulatus）、斑馬魚(yú)、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）、歐洲鱸、胭脂魚(yú)（Chinese sucker）等魚(yú)種中克隆到了HIF-1α基因［34—39］。Blast比對(duì)結(jié)果顯示， 本實(shí)驗(yàn)中所克隆到的半滑舌鰨HIF-1α基因序列片段與大部分魚(yú)類(lèi)具有較高的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示舌鰨HIF-1α氨基酸序列與大西洋鮭的進(jìn)化地位最近， 并且與其他魚(yú)類(lèi)緊密聚為一支， 與哺乳類(lèi)和禽類(lèi)的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中， 飼料中不同谷氨酰胺水平對(duì)低氧應(yīng)激后舌鰨內(nèi)臟團(tuán)HIF-1α mRNA表達(dá)量的影響不顯著， 出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是由于HIF-1α在轉(zhuǎn)錄水平上不受營(yíng)養(yǎng)調(diào)控［40， 41］， 具體谷氨酰胺是否能在轉(zhuǎn)錄后水平上影響低氧應(yīng)激后半滑舌鰨HIF-1α的表達(dá)還需要進(jìn)一步的研究探討。

綜上所述， 飼料中添加谷氨酰胺能夠顯著增強(qiáng)半滑舌鰨稚魚(yú)魚(yú)體溶菌酶活力（P＜0.05）， 提高非特異性免疫水平， 但是飼料中谷氨酰胺水平對(duì)低氧應(yīng)激后半滑舌鰨稚魚(yú)HIF-1α mRNA表達(dá)量影響不顯著（P＞0.05）。

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EFFECTS OF DIETARY GLUTAMINE ON ACTIVITIES OF NON-SPECIFIC IMMUNE RELATED ENZYMES AND HIF-1α EXPRESSION AFTER HYPOXIA OF HALF-SMOOTH TONGUE SOLE POST LARVAE

LIU Jing-Wei， MAI Kang-Sen， XU Wei， ZHANG Yan-Jiao， ZHOU Hui-Hui and AI Qing-Hui
（Key Laboratory of Mariculture， Certificated by Education Ministry of China， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）

To investigate effects of dietary glutamine on activities of non-specific immune related enzymes and antihypoxia stress capacity of half-smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevis Günther） post larvae， four isonitrogenous and isolipidic experimental diets supplemented with 0， 0.5%， 1.0% and 2.0% gluta-mine （with dietary free glutamine estimated to be about 0.03%， 0.46%， 0.91% and 1.73%） were formulated and fed 5 times per day to C. semilaevis post larvae （35 days after hatching， 10.64±0.86 mg dry weight） for 30 days before hypoxia stress test. Results revealted that the 0.5% glutamine supplemented diet significantly increased activities of lysozyme in fish whole body compared to the control group （P＜0.05）， but different glutamine level did not impact the activities of total nitric oxide synthase and inducible nitric oxide synthase in fish whole body （P＞0.05）. C. semilaevis HIF-1α gene were cloned and 749 bp partial cDNA sequence were obtained， which shared high identities with many other fish species. Quantitative Real-time PCR showed that glutamine supplementation did not regulate the expressions of HIF-1α in fish after hypoxia stress （P＞0.05）. In summary， dietary glutamine could enhacne the activities of LZM and the non-specific immunity of C. semilaevis post larvae.

Glutamine； Cynoglossus semilaevis； Post larvae； Non-specific immune； HIF1-α； Gene cloning and expression

S963.7

A

1000-3207（2016）04-0736-08

10.7541/2016.97

2015-04-08；

2015-11-24

國(guó)家鲆鰈類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)： CARS50-G08）資助 ［Supported by the National Flatfish Industry System Construction Programme （No. CARS50-G08）］

劉經(jīng)緯（1989—）， 女， 河北承德人； 碩士； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail： kivi_liu@163.com

艾慶輝， 教授； qhai@ouc.edu.cn