車 鑫，毛 健，3，*，劉雙平，3，周志磊，3，薛景波（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000）

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產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選及中藥對(duì)其固態(tài)發(fā)酵的影響

車 鑫1，2，毛 健1，2，3，*，劉雙平1，2，3，周志磊1，2，3，薛景波1，2
（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000）

摘 要：經(jīng)洛伐他?。∕onacolin K）抗性平板篩選和固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從紅曲分離源中得到一株產(chǎn)洛伐他汀能力最強(qiáng)的菌株，并命名為M2-1，發(fā)酵12 d后其洛伐他汀產(chǎn)量可達(dá)1.472 mg/g（以干基計(jì)）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析，將其鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）?？疾?5 種藥食同源中藥及其添加形式（藥粉、藥汁）對(duì)菌株M2-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀、色價(jià)等指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示：陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制備藥紅曲效果最佳（P＜0.05），其中陳皮粉紅曲和山楂汁紅曲的洛伐他汀和色價(jià)最高，分別為2.118 mg/g和320.12 U/g，分別較普通紅曲提高43.89%和71.79%。本研究發(fā)現(xiàn)多種中藥能夠促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)洛伐他汀和紅曲色素，為進(jìn)一步提升傳統(tǒng)紅曲的藥食兩用功能提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：紅色紅曲菌；中藥；固態(tài)發(fā)酵；洛伐他??；色價(jià)

引文格式：

車鑫， 毛健， 劉雙平， 等.產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選及中藥對(duì)其固態(tài)發(fā)酵的影響［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 114-119.

紅曲菌屬真菌（Monascus spp.）接種于大米，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵得到的制品即為紅曲［1］。紅曲是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用發(fā)酵產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于食品著色、酒類糖化發(fā)酵、肉類保鮮、降脂保健醫(yī)療等各個(gè)領(lǐng)域［2］。紅曲菌在發(fā)酵過程中能代謝產(chǎn)生紅素色素、水解酶類、洛伐他?。∕onacolin K）、麥角固醇、γ-氨基丁酸等多種有益物質(zhì)［2-4］。其中，紅曲色素是一類天然、安全的食品著色劑，普遍存在于紅曲產(chǎn)品中，其有效成分通常以色價(jià)表示［5］；洛伐他汀為一種關(guān)鍵的降脂功效成分，臨床研究表明，洛伐他汀紅曲具有降脂效果顯著、無(wú)不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。然而，并非所有紅曲菌屬真菌都能代謝產(chǎn)生洛伐他汀，從目前報(bào)道來看［3］，主要以紅色紅曲菌（M.ruber）、紫色紅曲菌（M.purpureus）和叢毛紅曲菌（M.pilosus）3 個(gè)種為主，其野生菌株的洛伐他汀固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量一般在0.53～2.80 mg/g。

固態(tài)發(fā)酵因具有投資少、能耗低、產(chǎn)量高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，已得到世界各國(guó)的重視［8］。目前關(guān)于提高固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)條件優(yōu)化和生物反應(yīng)器選擇等方面［9-11］。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些外源添加物如中藥，能進(jìn)一步較大幅度地提高真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量：羅芳等［12］考察了21 種中藥對(duì)米曲制備的影響，發(fā)現(xiàn)紅景天、黃芪、西洋參對(duì)糖化酶活力和液化酶活力的提高效果最為顯著，提高率為36.76%～59.43%；崔培梧等［13］研究發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的黃芪、茶葉、麥芽、三七、葛根或穿心蓮，均能使茯苓菌發(fā)酵體系表現(xiàn)出極強(qiáng)的胞外多糖合成能力，認(rèn)為植物藥能起到發(fā)酵調(diào)控作用；劉高強(qiáng)等［14］研究了5 種藥用昆蟲對(duì)靈芝多糖生物合成的影響，結(jié)果表明蜣螂在添加量為5 g/L時(shí)，雖不能促進(jìn)靈芝細(xì)胞的生長(zhǎng)，但卻能顯著促進(jìn)靈芝多糖的形成（P＜0.05），提示蜣螂蟲粉中含有促進(jìn)靈芝多糖形成的功能因子?？梢?，中藥的引入可為固態(tài)發(fā)酵調(diào)控提供一種新的策略和手段。另外，中藥本身具有一定的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和功能性成分，應(yīng)用于發(fā)酵可以增加產(chǎn)品的附加值。例如我國(guó)一些釀造法制備的藥酒（如董酒）在糧醅拌曲發(fā)酵時(shí)加入藥粉或藥汁，不僅起到調(diào)控釀酒微生物發(fā)酵的作用，亦能提升酒體的香味和保健功效。綜上可見，中藥與固態(tài)發(fā)酵實(shí)踐相結(jié)合具有重要意義，而有關(guān)中藥影響產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的固態(tài)發(fā)酵目前未見報(bào)道。

曾有學(xué)者探討了中藥對(duì)釀酒紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響［15］，結(jié)果表明，西洋參和紅景天能夠顯著提高紅曲酶活。借鑒該研究思路，本研究從我國(guó)傳統(tǒng)制曲用藥和相關(guān)文獻(xiàn)常見藥材中遴選出15 味藥食同源中藥，考察其對(duì)產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌固態(tài)發(fā)酵洛伐他汀、色價(jià)等指標(biāo)的影響，以期為深度開發(fā)藥食兩用紅曲提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基和藥材

1.1.1 紅曲樣品

從福建寧德、三明市，浙江溫州、麗水市和廣東梅州市采集11 份紅曲樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離和保藏培養(yǎng)基（g/L）：麥芽汁粉100、瓊脂20，自然pH值；察式酵母提取粉瓊脂（Czapek's yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基［16］；洛伐他汀抗性培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉5、蛋白胨1、瓊脂20、洛伐他汀0～800，自然pH值。以上培養(yǎng)基于0.1 MPa滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：取35 g秈米用pH 5.0乳酸水浸泡2 h，瀝干后裝入250 mL三角瓶，8 層紗布封口后于0.08 MPa滅菌20 min，趁熱搖散米粒，冷卻至室溫備用。

1.1.3 中藥

白芷、丁香、茯苓、黑胡椒、肉豆蔻、杏仁、桑葉、甘草、赤小豆、牡蠣、枸杞、桑葚、麥芽、陳皮、山楂，均屬藥食同源藥材，購(gòu)自無(wú)錫山禾集團(tuán)中藥飲片有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ系列超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)（配有2489紫外檢測(cè)器及Empower 2色譜工作站） 美國(guó)沃特世公司；CX31RTSF顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)洛伐他汀菌株的篩選

初篩：稱取紅曲樣品5 g至盛有95 mL帶玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩20 min后取懸浮液0.5 mL進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)5～6 d，滅菌牙簽挑取單菌落轉(zhuǎn)至新的分離平板，相同條件下多次純化，結(jié)合顯微形態(tài)挑選具有紅曲菌基本特征的菌株［16］，于4 ℃斜面保藏。

復(fù)篩：使抗性培養(yǎng)基的洛伐他汀質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg/L，三點(diǎn)接種斜面保藏的菌株，于28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，選擇在高質(zhì)量濃度洛伐他汀平板上生長(zhǎng)良好的菌株。

固態(tài)發(fā)酵驗(yàn)證：考察復(fù)篩菌株，以接種量105個(gè)孢子/g（以干基計(jì)）接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；補(bǔ)加pH 5.0乳酸水使干基水分含量為0.8；搖瓶使培養(yǎng)基堆至瓶?jī)?nèi)一角，于28 ℃靜置培養(yǎng)2 d；用無(wú)菌藥匙將培養(yǎng)基搗散、攤平，以吸收瓶?jī)?nèi)水分；此后每24 h搖瓶1 次，直到第12天發(fā)酵結(jié)束。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定洛伐他汀產(chǎn)量，選擇產(chǎn)量高的菌株用于后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.2 菌株鑒定

個(gè)體形態(tài)觀察：采用載片培養(yǎng)法在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，用乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液制成水浸片，高倍鏡下觀察受試菌的個(gè)體形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

菌落形態(tài)觀察：采用點(diǎn)種法將受試菌接種于CYA培養(yǎng)基，在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征，包括大小、顏色、表面質(zhì)地、邊緣。

分子生物學(xué)鑒定：以受試菌總DNA［17］為模板，采用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer of ribosomal DNA，rDNA-ITS）通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果通過BLAST程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選取同源性高的模式菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［18］。

1.3.3 藥紅曲的制備

藥粉準(zhǔn)備：中藥于45 ℃烘干24 h，粉碎后取20～50 目細(xì)粉，0.8 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后于4 ℃冰箱保存。

藥汁準(zhǔn)備：取上述藥粉4 g于50 mL離心管，加入20 mL去離子水，室溫浸泡4 h，0.8 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后5 000 r/min離心15 min，取上清于4 ℃冰箱保存。

固態(tài)發(fā)酵：取0.2 g藥粉或1 mL藥汁加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1.3.1節(jié)固態(tài)發(fā)酵方法培養(yǎng)得到藥紅曲，測(cè)定發(fā)酵失質(zhì)量、洛伐他汀產(chǎn)量和色價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，以不加藥的普通紅曲為空白對(duì)照。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵失質(zhì)量：稱量（精確至0.001 g）發(fā)酵起始培養(yǎng)基濕質(zhì)量與發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)基濕質(zhì)量，兩者之差即得發(fā)酵失質(zhì)量。

洛伐他汀產(chǎn)量：采用HPLC法，準(zhǔn)確稱取紅曲粉0.5 g置于50 mL比色管，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇30 mL，50 ℃超聲提取1 h（250 W，40 kHz），搖勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜。色譜條件：色譜柱：Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%的磷酸水溶液（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：（30.0±0.5）℃。外標(biāo)定量，結(jié)果以酸式洛伐他汀計(jì)。

色價(jià)：采用分光光度計(jì)法，參見國(guó)標(biāo)GB 4926—2008《食品添加劑 紅曲米（粉）》。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用逼近理想點(diǎn)排序法（technique for order preference by similarity to an ideal solution，TOPSIS）對(duì)1.3.3節(jié)的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)以確定最優(yōu)藥紅曲方案。基于同向化、歸一化后的原始數(shù)據(jù)矩陣，找出理論最優(yōu)、最劣方案，然后分別計(jì)算各評(píng)價(jià)方案與最優(yōu)、最劣方案間的歐式距離，獲得各評(píng)價(jià)方案與最優(yōu)方案的相對(duì)接近程度，以此作為評(píng)價(jià)優(yōu)劣的依據(jù)［19］。顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 菌株篩選結(jié)果

經(jīng)梯度稀釋和分離培養(yǎng)基純化，從11 份紅曲樣品中獲得純培養(yǎng)菌株共計(jì)32 株，經(jīng)顯微鏡檢初篩，得到9 株具有紅曲菌典型特征的菌株，命名為M1、M6、M8、M9、M11、M17、M2-1、M2-2、M3-1。接種于洛伐他汀抗性培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d后，菌株生長(zhǎng)情況有明顯差異（圖1）。以菌株M6、M8和M2-1為例，空白平板（左起第一列）所有菌株均能正常生長(zhǎng)，抗性平板僅菌株M2-1能夠生長(zhǎng)但長(zhǎng)勢(shì)較空白平板稍差，但未發(fā)現(xiàn)受高質(zhì)量濃度洛伐他汀抑制現(xiàn)象。結(jié)果表明，洛伐他汀會(huì)對(duì)真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，與此前的報(bào)道一致［20-21］；菌株M2-1對(duì)高質(zhì)量濃度洛伐他汀不敏感，是高產(chǎn)洛伐他汀的潛在菌株，故選為目標(biāo)菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵驗(yàn)證。

2.1.2 菌株產(chǎn)洛伐他汀的固態(tài)發(fā)酵驗(yàn)證

以菌株M2-1固態(tài)發(fā)酵紅曲，采用HPLC精確定量洛伐他汀，以其他菌株為對(duì)照。由圖2可知，菌株M2-1的洛伐他汀產(chǎn)量為1.472 mg/g（以干基計(jì)，下同），顯著高于其他菌株，故確定菌株M2-1為供試菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌株M2-1的鑒定

2.2.1 菌落和個(gè)體形態(tài)學(xué)特征

由圖3a、b可知，在高倍顯微鏡鏡下觀察，菌株M2-1的閉囊殼呈球形，直徑45 μm左右，單生在菌絲上，由糾結(jié)的菌絲構(gòu)成；菌絲具有橫隔，3～6 μm寬；分生孢子成串著生在菌絲頂端，倒梨形或球形。由圖3c可知，25 ℃條件下，在CYA平板上培養(yǎng)7 d后，菌株M2-1菌落直徑20～23 mm，放射狀，邊緣呈流蘇狀，褐色，平坦，表面質(zhì)地叢卷毛狀。參照《真菌鑒定手冊(cè)》［22］和《紅曲菌的形態(tài)與分類學(xué)》［16］，菌株M2-1可初步鑒定為紅曲菌屬（Monascus spp.）。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

2）自動(dòng)化控制系統(tǒng)。地面控制系統(tǒng)均為撬裝OCS控制器獨(dú)立運(yùn)行，地面壓力信號(hào)與現(xiàn)場(chǎng)井口BB井控系統(tǒng)進(jìn)行聯(lián)鎖。當(dāng)?shù)孛媲搜b設(shè)備壓力高于設(shè)定值時(shí)自動(dòng)關(guān)井，具有緊急關(guān)井聯(lián)鎖功能，從而確保運(yùn)行安全可靠。地面各撬裝采用就地控制與中控室控制相融合，撬塊上的各重要工藝參數(shù)的顯示、控制、報(bào)警以及各相關(guān)邏輯聯(lián)鎖保護(hù)控制均由中控室DCS+PC系統(tǒng)進(jìn)行遠(yuǎn)程監(jiān)控。

菌株M2-1的rDNA-ITS PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由圖4可知，產(chǎn)物條帶單一、明亮，說明特異性擴(kuò)增良好，測(cè)序后得到長(zhǎng)度為582 bp的序列，在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)與紅色紅曲菌Monascus ruber FRR2447的同源性達(dá)99%以上，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），菌株M2-1與Monascus ruber的親緣關(guān)系最近（相似度100%）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株M2-1鑒定為Monascus ruber。該種是常見的三大紅曲固態(tài)發(fā)酵菌種之一［23］，具有較強(qiáng)的產(chǎn)洛伐他汀和紅曲色素能力。

2.3 中藥對(duì)紅色紅曲菌M2-1固態(tài)發(fā)酵的影響

2.3.1 對(duì)發(fā)酵失質(zhì)量的影響

長(zhǎng)時(shí)間的紅曲固態(tài)發(fā)酵過程中，底物經(jīng)紅曲菌分解代謝后產(chǎn)生水和二氧化碳，水分蒸發(fā)和二氧化碳逸出造成質(zhì)量損失，因此發(fā)酵失質(zhì)量能夠反映紅曲菌的代謝活躍程度［24］。由圖6可知，與空白對(duì)照組相比，添加白芷粉/汁、丁香粉、茯苓粉、黑胡椒粉、肉豆蔻粉、桑葉粉、甘草粉、赤小豆粉、牡蠣粉、枸杞粉、桑葚汁、山楂汁紅曲的發(fā)酵失質(zhì)量增加；添加茯苓汁、肉豆蔻汁、杏仁粉/汁、桑葉汁、甘草汁、牡蠣汁、桑葚粉、陳皮汁時(shí)發(fā)酵失質(zhì)量降低；添加丁香汁、黑胡椒汁、赤小豆汁、枸杞汁、麥芽粉/汁、陳皮粉、山楂粉對(duì)發(fā)酵失質(zhì)量影響不明顯。結(jié)果表明，15 種中藥材對(duì)紅曲菌的生長(zhǎng)代謝有三方面作用：促進(jìn)、無(wú)效和抑制，原因可能是中藥的多種成分綜合作用于菌體生長(zhǎng)的結(jié)果［25］，其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

由圖7可知，普通紅曲洛伐他汀產(chǎn)量為1.472 mg/g，添加白芷粉/汁、丁香汁、茯苓粉、黑胡椒汁、杏仁粉、桑葉粉、枸杞粉/汁、桑葚粉、麥芽粉、陳皮粉/汁、山楂粉/汁發(fā)酵對(duì)洛伐他汀的生成有促進(jìn)作用，其中以陳皮粉效果最顯著（P＜0.01），達(dá)到2.118 mg/g，較普通紅曲提高43.89%；而添加茯苓粉/汁、黑胡椒粉、肉豆蔻粉/汁、桑葉汁、甘草粉、赤小豆粉、牡蠣粉、桑葚汁、麥芽汁發(fā)酵對(duì)洛伐他汀的生成有抑制作用；白芷汁、丁香粉、杏仁汁、甘草汁、赤小豆汁、牡蠣汁的添加對(duì)洛伐他汀的生成影響不明顯。上述結(jié)果表明，中藥種類與添加形式（藥粉、藥汁）均會(huì)對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響，與李麗等［15］的研究結(jié)論一致。由于受試藥材本身不含他汀類物質(zhì)，因此可判定紅曲洛伐他汀產(chǎn)量的提高來源于中藥的間接作用，其機(jī)理可能是中藥弱極性或非極性成分（如中、長(zhǎng)鏈脂肪酸）使紅曲菌細(xì)胞膜通透性增加，從而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和洛伐他汀的分泌［26］，或是中藥的有效物質(zhì)能影響生物合成途徑，有利于洛伐他汀的生成［27］。

2.3.3 對(duì)色價(jià)的影響

色價(jià)能在一定程度上反映紅曲色素含量的高低和著色能力的強(qiáng)弱。由圖8可知，添加白芷粉、丁香汁、黑胡椒汁、桑葉粉、陳皮粉、山楂粉/汁有利于提高紅曲色價(jià)，其中山楂汁的效果最為顯著（P＜0.01），達(dá)到320.12 U/g，較普通紅曲提高71.79%；丁香粉對(duì)紅曲色價(jià)無(wú)明顯作用；除以上藥材外，其他藥材的添加均會(huì)從不同程度上降低紅曲色價(jià)，說明在本實(shí)驗(yàn)藥材的添加量下，抑制紅曲色素合成的因子起主導(dǎo)作用，但根據(jù)趙燕等［28］的報(bào)道，不排除有促進(jìn)因子的存在，需通過改變添加量進(jìn)行驗(yàn)證。中藥對(duì)色價(jià)的影響相對(duì)洛伐他汀指標(biāo)更加復(fù)雜，因?yàn)樗幉某煞殖丝梢蚤g接作用于紅曲菌產(chǎn)色素外，一些藥材（如黑胡椒、陳皮、山楂等）自身的天然色素也可直接貢獻(xiàn)于紅曲色價(jià)；雖然枸杞紅色素在本實(shí)驗(yàn)的低溫和酸性發(fā)酵環(huán)境下較穩(wěn)定［29］，能夠?qū)ι珒r(jià)產(chǎn)生直接正效應(yīng)，但可能不足以抵消枸杞中抑制因子產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)，因此最終表現(xiàn)為降低紅曲色價(jià)；此外，紅曲色素的產(chǎn)生是一個(gè)耗氧過程［30］，而藥粉能夠疏松曲料，有利于氧氣傳遞，這可能是桑葉粉紅曲色價(jià)較高的部分原因。

2.3.4 確定最佳制曲藥材

注：Di+.評(píng)價(jià)方案與最優(yōu)方案的歐氏距離；Di－.評(píng)價(jià)方案與最劣方案的歐氏距離；Ci.評(píng)價(jià)方案與最優(yōu)方案的接近程度，Ci∈［0，1］，其值越大，評(píng)價(jià)結(jié)果越優(yōu)。

TOPSIS法是一種優(yōu)秀的多目標(biāo)決策和多屬性評(píng)價(jià)方法，具有計(jì)算簡(jiǎn)便、應(yīng)用靈活的優(yōu)點(diǎn)，在經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、科技、環(huán)境等領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用［19，31］。根據(jù)圖5～7中的數(shù)據(jù)，利用該法對(duì)藥紅曲綜合評(píng)價(jià)?？紤]到發(fā)酵失質(zhì)量指標(biāo)的增加會(huì)造成產(chǎn)品得率下降，故將其確定為低優(yōu)指標(biāo)，而洛伐他汀和色價(jià)顯然為高優(yōu)指標(biāo)。用藥方案的優(yōu)劣按照Ci值排序，結(jié)果見表1。排序前7位藥紅曲的Ci值顯著高于普通紅曲（Ci＞0.555，P＜0.05），即陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉用于制備藥紅曲效果最佳。從藥材成分來看，這些藥材的纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分可被紅曲菌的酶系分解，用于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成；從中藥理論來看，這些藥材大多屬溫性，味苦、辛，與紅曲藥性相近而味相反，根據(jù)傳統(tǒng)制曲用藥規(guī)律［32］，促進(jìn)真菌活動(dòng)和抑制細(xì)菌繁殖的雙重作用可能是這些藥材制曲效果較好的原因。

3 結(jié) 論

洛伐他汀作為紅曲菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，會(huì)在一定程度上抑制其自身生長(zhǎng)。本研究利用該原理從紅曲分離源中篩選得到一株對(duì)洛伐他汀抗性最強(qiáng)的菌株M2-1，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其洛伐他汀產(chǎn)量也最高，該菌株能在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)（12 d）發(fā)酵積累較高的洛伐他?。?.472 mg/g），通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）。

藥材種類和添加形式對(duì)紅色紅曲菌M2-1固態(tài)發(fā)酵影響顯著。通過TOPSIS綜合評(píng)價(jià)結(jié)果可知，陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制備藥紅曲的效果顯著優(yōu)于普通紅曲（P＜0.05），其中，陳皮粉紅曲的洛伐他汀產(chǎn)量和山楂汁紅曲的色價(jià)最高，分別較普通紅曲提高43.89%和71.79%。本研究為進(jìn)一步提高紅曲的降脂保健和著色效果提供了新的思路，對(duì)深度開發(fā)藥食兩用紅曲有良好的應(yīng)用前景。此外，中藥添加量和復(fù)配作用會(huì)如何影響紅曲固態(tài)發(fā)酵，還需作進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0114-06

收稿日期：2015-09-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571823）

作者簡(jiǎn)介：車鑫（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：403995925@qq.com

*通信作者：毛?。?970—），男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：biomao@263.net

Screening of Monacolin K-Producing Monascus and Effects of Chinese Medicinal Herbal Materials on Monacolin K Production in Solid-State Fermentation

CHE Xin1，2， MAO Jian1，2，3，*， LIU Shuangping1，2，3， ZHOU Zhilei1，2，3， XUE Jingbo1，2
（1.School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine， Shaoxing 312000， China）

Abstract:One strain with the most powerful capability of producing Monacolin K named M2-1 was screened from red mold rice （RMR） using Monacolin K-containing plates and validated by solid-state fermentation.The yield of Monacolin K reached 1.472 mg/g （dry basis） after 12 d fermentation.The strain was identified as Monascus ruber by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.The effects of powders and water extracts of 15 edible and medicinal herbs on Monacolin K production and color value of M2-1 in solid-state fermentation were studied.Results indicated that Pericarpium Citri Reticulatae， Fructus Crataegi， Folium Mori and Radix Angelicae Dahuricae powder as well as Fructus Crataegi， Flos Caryophylli and Fructus Piperis extracts significantly improved the quality of RMR （P < 0.05）.By adding Pericarpium Citri Reticulatae powder and Fructus Crataegi extract to the fermentation medium， the maximum Monacolin K production of 2.118 mg/g and the highest color value of RMR of 320.12 U/g were obtained which were increased by 43.89% and 71.79% compared those obtained with the ordinary strain， respectively.This study discovered a variety of Chinese medicinal herbs that could promote the production of Monacolin K and Monascus pigment by Monascus ruber， which will provide a novel strategy for improving the efficacy of traditional RMR as an edible and medicinal resource.

Key words:Monascus ruber； Chinese medicinal herb； solid-state fermentation； Monacolin K； color value