王云霞　張　鑫

西安市食品藥品檢驗(yàn)所(西安 710054)

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·方藥縱橫·

變換波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量

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西安市食品藥品檢驗(yàn)所(西安 710054)

摘要目的：考察不同波長(zhǎng)和酸度對(duì)HPLC法測(cè)定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量的影響。方法：采用Welch C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫(0-15 min 40∶60，15-50 min 40→84；60→16，50-60 min 84∶16) 柱溫30℃，流速1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm(橙黃決明素)和254 nm(大黃酚)。結(jié)果：橙黃決明素和大黃酚分別在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范圍內(nèi)峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為101.0%(RSD=0.8%)和99.8%(RSD=0.72%)。結(jié)論: 該方法具有準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為決明子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)提供一定依據(jù)。

主題詞決明子色譜法，高壓液相 @橙黃決明素 @大黃酚

決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，具有清熱明目，潤(rùn)腸通便的作用，臨床主要用于目赤澀痛，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結(jié)等癥狀[1-2]。決明子中的主要成分有蒽醌類，目前對(duì)其研究主要有單波長(zhǎng)高效液相色譜法[2-4]，液質(zhì)連用[5]，指紋圖譜法[6]對(duì)其化學(xué)成分和有效成分進(jìn)行測(cè)定。本文通過采用變換波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量，并研究酸度對(duì)其含量測(cè)定的影響，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有精密度高，重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以用于決明子藥材的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥Agilent1260高效液相色譜儀；WelchC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；BT124S型電子天平(德國(guó)賽多利斯)，對(duì)照品：橙黃決明素(批號(hào)111900-201303)，含量為99.1%，大黃酚(批號(hào)110796-201017)，含量為99.6%，對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定使用，決明子藥材經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室謝志民主任藥師鑒定為豆科植物決明的干燥種子，甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，鹽酸為分析純，其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果2.1色譜條件WelchUltimateXB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫(0-15min40∶60，15-50min40→84；60→16，50-60min84∶16) 柱溫30℃，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)284nm(橙黃決明素)和254nm(大黃酚)。進(jìn)樣量：10μL，在此條件下測(cè)定對(duì)照品和供試品溶液，見圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙黃決明素10.88mg和大黃酚7.44mg至100ml容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，后經(jīng)稀釋制成每1ml含橙黃決明素、大黃酚分別約為20μg/ml，作為對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取本品粉末(過三號(hào)篩)0.5g，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，蒸干，加稀鹽酸30ml置水浴中加熱水解1h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取橙黃決明素和大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1ml，3ml，5ml，5ml分別稀釋至100ml，25ml，25ml，10ml和儲(chǔ)備液進(jìn)樣10μL進(jìn)行線性回歸，橙黃決明素和大黃酚的回歸方程分別為：Y=7198.122X-6.692，r=0.9999，大黃酚Y=5342.143X+26.444，r=0.9999,分別在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL, 連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，供試品溶液中橙黃決明素和大黃酚的的RSD分別為0.51%，0.38 %，結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL, 分別在0, 2，4，8，12，24h測(cè)定，結(jié)果橙黃決明素和大黃酚的的RSD分別為0.26%，0.43 %，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批決明子藥材，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣量10μL，結(jié)果橙黃決明素的平均含量為0.128%，RSD為1.21%，大黃酚的平均含量為0.107%，RSD為1.04%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品6份，然后分別加入一定量的橙黃決明素和大黃酚的對(duì)照品，按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算橙黃決明素的平均回收率為99.8%，RSD=1.25%，大黃酚的平均回收率為101.2%，RSD=1.72%。

2.9樣品含量的測(cè)定 精密稱取決明子粉末(過3號(hào)篩)0.5g，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的含量，結(jié)果如下：橙黃決明素含量分別為0.240%，0.119%，0.126%，大黃酚的含量分別為0.110%，0.115%，0.103%。

3討論 色譜條件的選擇：2010年版藥典中決明子含量測(cè)定采用同一波長(zhǎng)284nm對(duì)橙黃決明素和大黃酚進(jìn)行檢測(cè)，2015版仍未做修改，但是筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)284nm下測(cè)定大黃酚具有一定的局限性，在做薄層鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)大黃酚的斑點(diǎn)非常明顯，而在液相色譜中，大黃酚峰面積較小，干擾大，當(dāng)含量較低時(shí)，不易檢測(cè)，故本實(shí)驗(yàn)采用變換波長(zhǎng)法在284nm下檢測(cè)橙黃決明素，在254nm下檢測(cè)大黃酚，會(huì)大大減少干擾，提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)采用不同比例的乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離度不好，故采用本實(shí)驗(yàn)的梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果分離度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。供試品溶液制備的考察，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)制備過程中水解HCl溶液濃度(5%，10%，15%)水解時(shí)間分別為(0.5h，1h，1.5h)進(jìn)行考察，得到最佳方法為HCl濃度為10%，水解時(shí)間為1h時(shí)含量最高，并且我們用9種供試液對(duì)原波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)無論哪個(gè)條件下的大黃酚峰面積變化不大，而在254nm下檢測(cè)大黃酚變化非常明顯，以本實(shí)驗(yàn)條件為最佳。

參考文獻(xiàn)

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(收稿2016-03-22；修回2016-05-15)

【中圖分類號(hào)】282.71

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.067