任英華，艾紅軍，劉 學，倪 卓，王 楊，章立群

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實驗研究

PEEK/HA對成骨細胞(MG63)增殖分化的影響

任英華，艾紅軍，劉 學，倪 卓，王 楊，章立群

目的 研究納米PEEK/HA復合材料對MG63細胞相容性的影響。方法 應用流式細胞儀技術研究不同組分的復合材料浸提液中MG63細胞增殖的情況；應用實時定量RT-PCR技術檢測復合材料浸提液中MG63細胞特征性蛋白堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原的表達情況。結果 流式細胞儀實驗結果顯示，4種浸提液中培養(yǎng)的MG63細胞，48 h后，均有穩(wěn)定的增殖。10%HA/SPEEK/PEEK組增殖指數為59.3%，高于其他4組，差異有統(tǒng)計學意義。實時定量RT-PCR實驗結果顯示，4種材料的浸提液培養(yǎng)MG63細胞于14、21、28 d時成骨細胞特征性的蛋白ALP、COLI的DNA的量表達明顯。10%nHA/SPEEK/PEEK組表達高于其他4組，差異有統(tǒng)計學意義。隨著時間的延長，各組的表達均有所下降。結論 納米PEEK/HA復合材料對MG63細胞有良好的生物相容性。

PEEK/HA復合材料； MG63成骨細胞； 細胞增殖

當今社會，由于腫瘤術后及外傷等造成骨缺損的患者越來越多，尤其是頜面部骨缺損，嚴重影響美觀和功能，因此，人們對生物醫(yī)用骨替代材料的需求日益增加。在臨床上常用的骨替代材料是金屬，金屬可以提供良好的機械強度、優(yōu)異的摩擦性和無毒特性[1]。然而，因其存在一些顯著缺點，阻礙了其更廣泛的醫(yī)療應用[2]。羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)具有極好的生物相容性和生物活性，但其機械強度比人類骨皮質差。聚醚醚酮(polyether ether ketone, PEEK)具有穩(wěn)定的化學和物理性質[3]。然而，PEEK具有的生物惰性[4]使其應用潛力受到限制。因此，將HA與PEEK相混合，研制出性能優(yōu)越的生物材料，是目前各國學者亟待解決的問題。自2014-2015年，我們采用實驗室制備的PEEK/HA復合材料與MG63細胞共培養(yǎng)，檢測材料對MG63細胞特征性蛋白可能造成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 PEEK/HA生物復合材料(深圳大學化學實驗室)；RPMI-1640(美國GIBCO公司)；胎牛血清(美國HYCLONE公司)；細胞周期檢測試劑盒(碧云天)；Super M-MLV 反轉錄酶(北京BIOTEKE公司)；RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化有限公司)；RNase固相清除劑(天恩澤)；Powder瓊脂糖(西班牙SPAIN公司)；2×PowerTaqPCRMasterMix(北京BIOTEKE公司)；SYBR Green(北京SOLARBIO公司)。超純水系統(tǒng)(上海HEALFORC公司)；超速冷凍離心機(湖南湘儀公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力申公司)；倒置相差顯微鏡(麥克奧迪);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司);流式細胞儀(美國BD公司);微量移液器(芬蘭IOHIT公司)；紫外分光光度計(美國THERMO公司)。

1.2 流式細胞儀測定MG63細胞增殖指數 將對數生長期的MG63細胞制備成8 mg/ml的細胞懸液，去掉廢液，加入1 ml的PBS清洗細胞1次后去掉，各組分別加入4種材料培養(yǎng)基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml?？瞻捉M加正常培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48 h后進行細胞周期檢測。2000 r/min離心5 min收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，2000 r/min離心5 min收集細胞，小心吸除上清。加入預冷70%乙醇，4℃固定2 h。將固定后的細胞2000 r/min離心5 min收集細胞，棄去上清液，PBS清洗2次，2000 r/min離心5 min，棄上清液，每管細胞樣品中加入500 μl染色緩沖液，緩慢并充分重懸。加入25 μl碘化丙啶染色液混勻后，加入10 μl RNase A，混勻。37℃避光溫育30 min。冰浴避光存放，隨即進行流式檢測。

1.3 實時定量RT-PCR檢測MG63細胞特征性蛋白的表達 在對數生長的MG63細胞中，分別加入4種材料培養(yǎng)基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml，空白組加正常培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)14、21、28 d進行相關基因對的檢測。采用Real-time PCR法檢測MG63細胞內ALP和Ⅰ型膠原的基因表達情況?？俁NA提取試劑盒(天根)提取樣本總RNA，將得到的RNA樣本進行反轉錄，利用TIANScript RT Kit(TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒)，對上步實驗所得的RNA樣本進行反轉錄，以得到對應的cDNA。電泳分析(引物序列見表1)。 本實驗采用韓國BIONEER公司生產的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。根據PCR摸索的條件并結合實驗儀器，最終優(yōu)化得到的熒光定量反應體系及反應條件如下。反應體系：cDNA模板1 μl,上下游引物(10 μM)各0.5 μl,SYBR GREEN mastermix 10 μl,用ddH2O補足至20 μl；反應條件：95℃10 min；95℃10 s,60℃20 s,72℃30 s,4℃ 5 min,循環(huán)40次。首先將引物稀釋至10 μM或根據引物不同情況稀釋。

表1 引物序列表

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差加配對t檢驗法，分析MG63細胞增殖指數和MG63特征性蛋白的表達情況。所有的檢測數據至少重復3次，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀的檢測結果 流式細胞儀檢測后，4種材料的浸提液培養(yǎng)MG63細胞48 h后,細胞周期結果見圖1。MG63細胞維持良好的生長狀態(tài)，增殖迅速，很少發(fā)生凋亡。其中10%HA/SPEEK/PEEK組的PrI為59.3%，顯著高于其他組。SPEEK組高于PEEK組，高于空白組，低于HA組，差異不顯著。PEEK組低于空白組，低于HA組，差異不顯著。PrI為細胞增殖指數，PrI=(S+G2M)/(G01+S+G2M)。與空白組比較，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 Real-time RT-PCR檢測結果 4種材料的浸提液中，MG63細胞分泌ALP和Ⅰ型膠原的real-time RT-PCR檢測結果見圖2，3。P<0.05，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義。ALP：10%HA/SPEEK/PEEK組分泌的ALP高于其他組，與PEEK組差異有統(tǒng)計學意義。在14 d時與其他3組差異無統(tǒng)計學意義，在21、28 d時均略高于HA組，與其他兩組差異有統(tǒng)計學意義；SPEEK/PEEK組在14、21、28 d均明顯高于PEEK組，差異有統(tǒng)計學意義。略高于空白組，差異無統(tǒng)計學意義。在14 d時略低于HA組，在21、28 d時顯著低于HA組。PEEK組顯著低于空白組、HA 組。隨著時間的延長，各組分泌的ALP有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。Ⅰ型膠原：10%HA/SPEEK組分泌的Ⅰ型膠原高于其他4組，并且差異有統(tǒng)計學意義。SPEEK/PEEK高于PEEK組，14 d時差異無統(tǒng)計學意義，21、28 d時差異有統(tǒng)計學意義。高于空白組低于HA組，差異無統(tǒng)計學意義。PEEK組低于空白組，差異無統(tǒng)計學意義。低于HA組，差異有統(tǒng)計學意義。隨著時間的延長，各組分泌的COLI有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

PEEK的機械性質接近人體皮質骨[5]。例如，PEEK的彈性模量大約8.3 GPa，人體皮質骨的彈性模量為17.7 GPa。比Ti合金(116 GPa)和Co-Cr合金(210 GPa)低得多(J Black, 1998年) 。然而，PEEK并沒有明顯的促進成骨的能力[6]，但具有一定的生物惰性，這一缺點限制了其的應用潛力。因此，如何提高PEEK的生物活性，使其能夠充分實現(xiàn)潛在的顯著效益，是一個必須解決的難題。目前，有兩種主要方法已被用于改善PEEK的生物活性，包括表面改性和復合物的制備。表面改性大部分采用物理方法，化學處理是罕見的。只有濕化學處理或磺化處理可以用化學的辦法對PEEK進行改性。因此，本文中提到的磺化PEEK具有材料的先進性。

本研究中的另一種材料納米PEEK/HA復合物，是應用第二種方法來改善PEEK性能的，效果顯著。納米晶材料的典型特征是一微觀結構的長度或粒徑從幾納米到約100 nm。納米晶體的HA顆粒具有獨特的結構，與其微米尺寸對比[7]，顯示出較高的機械強度和優(yōu)異的生物相容性。HA納米顆粒結合到聚合物基體，可以接近模擬天然骨的結構。人骨是一種HA納米晶體和膠原纖維組成的生物復合材料。合成的納米HA已被發(fā)現(xiàn)，可以促進成骨細胞的黏附和有效地增殖[8]。目前，可以使用多種技術來獲得不同尺寸和形狀的納米HA，如化學共沉淀法、水熱路線、膠束模板來合成溶膠-凝膠等[9-11]。因此，可以將納米HA與PEEK相復合，以獲得矯形承重的潛力材料。 PEEK的生物惰性通常會產生不理想的骨植入物的整合[12]，但其生物活性和生物相容性，通過增加納米級別的HA可大大增強。有研究證明[13]，將納米級別的HA添加到PEEK中，可以刺激成骨細胞活性，從而誘導更多的骨生長。通過模仿人體骨骼的結構和特性，進而研制納米HA/PEEK復合材料。對其生物相容性進行探討是現(xiàn)階段研究的主要內容。

圖1 流式細胞儀測試5組MG63細胞的增殖情況 圖2 4組材料中MG63細胞ALP表達情況 圖3 4組材料中MG63細胞Collagen Ⅰ表達情況
Fig 1 Proliferation of MG63 cell in 5 groups detected by flow cytometry. Fig 2 Expression of ALP of MG63 cells in 4 groups. Fig 3 Expression of collagen Ⅰ of MG63 cells in 4 groups.

結合本實驗的結果，可以得出以下結論：4種PEEK復合材料浸提液中，MG63細胞均生長增殖良好。其中10%HA/SPPEK/PEEK浸提液組的MG63細胞的特征性蛋白表達最顯著；其次是HA組；第三是SPPEK/PEEK組；最低是PEEK組。但隨著時間的延長，特征性蛋白的表達均有所下降。為今后將納米HA/PEEK復合材料早日應用于臨床，起到了指導作用。

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Effects of PEEK/HA on proliferation and differentiation of MG63 cells

RENYing-hua,AIHong-jun,LIUXue,NIZhuo,WANGYang,ZHANGLi-qun.

(DepartmentofStomatology,ShenzhenNanshanPeople′sHospital,Shenzhen518052,China)

AIHong-jun,Email:13940066221@163.com;LIUXue,Email:xliu663@aliyun.com

Objective To study the effect of PEEK/HA composite materials on MG63 cell compatibility. Methods Flow cytometry(FCM) was used to study proliferation of MG63 in different components of the composite material leaching liquors. Real-time quantitative RT-PCR was adopted to detect the expression of proteins characteristic of alkaline phosphatase and type I collagen of MG63 cells in different components of the composite material leaching liquors. Results Flow cytometry results showed that MG63 cells cultured in the 4 leaching liquors at 48 hours had stable growth. The proliferative index in the 10% HA/SPEEK/PEEK group was 58.7% which was higher than that in the other three groups and the control group. The difference was statistically significant. Real-time quantitative RT-PCR results showed in MG63 cells cultured by 4 leaching liquors at 14 days, 21 days, 28 days, the expression of the characteristic protein ALP, and COLI of osteoblasts was obvious, especially in the 10% nHA/SPEEK/PEEK group which was higher than that in the other three groups and control group, the difference was significant. As time passed, the expression in each group has declined. Conclusion PEEK/HA composite materials have good biocompatibility with MG63 cells.

PEEK/HA composite material; MG63 Osteoblasts; Cell proliferation

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140411094009912)；深圳市南山區(qū)科技計劃項目(2014003)

518052 廣東 深圳，廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院 口腔科(任英華, 劉 學, 王 楊, 章立群);中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 修復科(艾紅軍)；深圳大學化學與化工學院(倪 卓)

任英華(1978-)，女，遼寧沈陽人，主治醫(yī)師，博士研究生.

艾紅軍，110002，中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 修復科，電子信箱：13940066221@163.com;劉 學，518052，廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院 口腔科，電子信箱：xliu663@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.020

R318.08

A

1673-7040(2016)04-0252-04

2015-11-20)