賈傳龍，陳 亮，楊清建，畢 波，盧勇周，郭 妤，朱晶晶，朱寧文，劉天一

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實驗研究

富血小板血漿對光老化皮膚成纖維細胞增殖的影響

賈傳龍，陳 亮，楊清建，畢 波，盧勇周，郭 妤，朱晶晶，朱寧文，劉天一

目的 探討梯度濃度的富血小板血漿對光老化皮膚成纖維細胞增殖能力的影響。方法 采用二次離心法制備富血小板血漿，利用紫外線照射的方法體外構(gòu)建鼠的真皮成纖維細胞光老化模型，倒置相差顯微鏡觀察在不同濃度富血小板血漿作用下，正常成纖維細胞以及光老化成纖維細胞的增殖情況。利用cck-8法測定不同濃度富血小板血漿培養(yǎng)條件下，正常成纖維細胞的生長曲線；利用細胞計數(shù)法計數(shù)不同時間段各組細胞數(shù)目。結(jié)果 正常成纖維細胞在1%、5%及10%濃度富血小板血漿作用下，細胞增殖量明顯多于陰性對照組。而對于光老化成纖維細胞，在加入低濃度的富血小板血漿(1%)后細胞數(shù)量增加，凋亡細胞數(shù)量減少；在加入高濃度的富血小板血漿(5%及10%)后，光老化成纖維細胞數(shù)量明顯減少，凋亡細胞數(shù)量增加。結(jié)論 在一定濃度范圍內(nèi)富血小板血漿對正常的成纖維細胞具有促進細胞增殖的作用，并且這種作用具有濃度依賴性。但對于光老化成纖維細胞，低濃度的富血小板血漿表現(xiàn)為減少光老化所致的細胞凋亡，而高濃度的富血小板血漿會加速光老化對成纖維細胞所造成的損傷。

富血小板血漿； 真皮； 成纖維細胞； 光老化； 細胞增殖

皮膚的老化包括內(nèi)源性老化和外源性老化兩種衰老進程[1]，其中內(nèi)源性老化主要受到內(nèi)在基因的調(diào)控，而外源性老化主要因受到紫外線的照射引起。真皮的成纖維細胞是內(nèi)嵌于真皮乳頭層和網(wǎng)狀層的主體細胞，可以分泌大量的細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等。紫外線特別是中波紫外線，可以穿透表皮損傷真皮的成纖維細胞，使成纖維細胞增殖發(fā)生受到影響，甚至凋亡[2-3]。

富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是全血經(jīng)分離后得到的血小板濃縮物，血小板中含有大量的生長因子，如血小板源性生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等[4]。這些具有生物學比例的生長因子能夠促進成纖維細胞的增殖，但在真皮成纖維細胞光老化的進程中，PRP是否能夠促進光老化成纖維細胞的增殖，以及這種增殖是否具有濃度依賴性鮮有報道。自2015年5月起，復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院研究不同梯度濃度的PRP對光老化皮膚成纖維細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚成纖維細胞的獲取 取1～3 d SPF級C57 BL/6小鼠1只，乙醚麻醉將其處死后，浸泡于75%乙醇中約10 min，用DMEM洗去殘留乙醇，置于培養(yǎng)皿中，分離背部皮膚，剪下皮膚組織塊約1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37℃恒溫消化4 h；將皮膚取出，鑷子分離表皮和真皮，將真皮剪碎后，置于0.1%膠原酶中，37℃恒溫搖床消化2 h，至組織塊基本消失。1500 r/min離心5 min，收集沉淀，棄上清液，細胞以DMEM+10%FBS制成細胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接近80%融合時進行傳代，比例約為1∶4。

1.2 PRP的制備及激活 用預(yù)先裝有2.0 ml枸櫞酸鈉的50 ml針筒及18 G針頭，以心臟取血的方式抽取新西蘭大白兔動脈血20 ml，注入2支塑料離心管中，每管10 ml。以Aghaloo法進行離心。離心分為2次，第1次以215 r/min離心10 min,吸取全部上清液至交界面下約3 mm，移至另一離心管，平衡后再次離心;第2次以863 r/min離心10 min，離心管中液體分為2層，上層上清液為貧血小板血漿(platelet poor plasma)，下層為血小板濃縮物(platelet concentrate, PC)。吸取約3/4上清液棄掉，剩余約1 ml搖勻，即為PRP。PRP制備后從中抽取10 μl，立即用全自動血細胞分析儀行血常規(guī)分析，并檢測血小板濃度，血小板計數(shù)均4倍高于全血則制備成功。在1 ml的PRP中加入100 μl的凝血酶激活劑，靜止30 min后以12 000 r/min 4℃的條件高速離心5 min，獲得的上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，存于-80℃保存?zhèn)溆谩?.3 成纖維細胞光老化模型的建立 本實驗成纖維細胞光老化模型的建立是借助于課題組之前通過UVB反復(fù)照射所建立的體外光老化細胞模型[5]。

1.4 實驗分組及不同濃度PRP的處理 將細胞按照每孔1×105的細胞密度接種于6孔板。實驗分為4組：正常細胞組、正常細胞+梯度濃度PRP組、光老化細胞組、光老化細胞+梯度濃度PRP組。正常細胞+梯度濃度PRP組分別以1%、5%、10%PRP濃度培養(yǎng)細胞；光老化組細胞按照細胞光老化模型的建立方法處理；光老化+梯度濃度PRP組在細胞光老化的進程中，分別以1%、5%、10%PRP濃度培養(yǎng)處理細胞，正常鼠成纖維細胞作為對照組。以上各組在處理48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞增殖變化，觀察光老化組細胞與1%PRP組細胞形態(tài)變化。

1.5 cck-8法測定不同濃度PRP對正常成纖維細胞增殖的影響 取P1代鼠成纖維細胞，以2000個/孔的密度接種于96孔板，將細胞分為不加PRP組、1%PRP組、5%PRP組、10%PRP組。每組4個復(fù)孔，分別加入體積分數(shù)為1%、5%、10%PRP進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)至24 h和48 h時分別向每組孔加10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在體積分數(shù)5% CO2恒溫孵箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定于450 nm波長處吸光度，繪制48 h內(nèi)細胞生長曲線。

1.6 細胞計數(shù)板計數(shù)24 h與48 h各組細胞數(shù) 在培養(yǎng)24 h與48 h時，向各組每個六孔板中加入0.2%胰酶0.5 ml進行消化約1 min；倒置相差顯微鏡下觀察：細胞被消化完全時加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。加樣槍吸取20 μl消化的細胞混懸液沖入細胞計數(shù)板，對各組細胞進行細胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PRP對正常成纖維細胞增殖的影響 細胞貼壁培養(yǎng)48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，正常細胞加入含有1%、5%、10%PRP后，細胞密度明顯增加。隨著PRP濃度的增高，細胞的增殖也相應(yīng)增加，細胞連接成片，伸展成長梭形樣結(jié)構(gòu)，生長旺盛，10%PRP組細胞由于增殖旺盛，甚至出現(xiàn)細胞接觸抑制現(xiàn)象。見圖1。

2.2 不同濃度PRP對光老化成纖維細胞增殖的影響 光老化細胞組細胞呈現(xiàn)肥大、鋪展，失去其正常長梭形的細胞結(jié)構(gòu)，在加入了梯度濃度的PRP后，光老化的細胞呈現(xiàn)出兩種狀態(tài)，1%PRP細胞組與光老化組細胞相比，細胞數(shù)量增多，密度增加，凋亡減少。而在5%和10%細胞組與光老化細胞組相比發(fā)現(xiàn)，后兩者的細胞數(shù)量減少，細胞密度降低，細胞凋亡增加。見圖2。

2.3 不同濃度PRP對光老化成纖維細胞增殖及形態(tài)的影響 成纖維細胞在光老化進程中，由于受紫外線直接與間接的損傷，細胞發(fā)生老化。圖3中可以觀察到光老化的成纖維細胞失去其長梭形的細胞結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為細胞肥大及鋪展的外觀。在實驗組中發(fā)現(xiàn)，加入1%PRP后，細胞數(shù)量較對照組細胞數(shù)量明顯增加，細胞仍保持其長梭形的結(jié)構(gòu)，較少出現(xiàn)衰老細胞肥大、鋪展的外觀。而在實驗過程中逐漸增加PRP的濃度，PRP改善細胞衰老表現(xiàn)的能力逐漸降低，細胞數(shù)量也逐漸減少,表現(xiàn)為1%、2%PRP時，細胞數(shù)量高于UVB組。3%PRP組與對照組相比，變化不大，4%PRP組的細胞形態(tài)與對照組相比，無明顯改善，且細胞數(shù)量也少于對照組。

2.4 不同濃度PRP對正常成纖維細胞的增殖作用 對于正常的成纖維細胞，從圖4可以看出，在48 h的時間段內(nèi)，不同濃度的PRP均具有促進正常成纖維細胞增殖的作用，且這種增殖作用表現(xiàn)為時間依賴性和濃度依賴性。

2.5 倒置相差顯微鏡下計數(shù)不同時間段內(nèi)各組細胞數(shù)每孔細胞數(shù) 通過計數(shù)24 h與48 h各組細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，對于正常細胞加入不同濃度PRP后細胞數(shù)量逐漸增加，在相同時間段內(nèi)，細胞數(shù)量增加的倍數(shù)與濃度具有相關(guān)性。而對光老化進行中的細胞，只有1%PRP組細胞數(shù)量較單純照射組細胞數(shù)量增加，5%PRP組與10%PRP組細胞數(shù)量較單純照射組均減少，且后者細胞數(shù)量減少更多(圖5)。

圖1 不同濃度PRP對正常成纖維細胞增殖的影響(×40) a. 對照組 b. 1%PRP組 c. 5%PRP組 d. 10%PRP組 圖2 不同濃度PRP對于光老化進程中成纖維細胞增殖的影響(×40) a. 對照組 b. 1%PRP組 c. 5%PRP組 d. 10%PRP組 圖3 不同濃度PRP對光老化成纖維細胞增殖與形態(tài)的影響(×100) 圖4 不同濃度PRP培養(yǎng)條件下正常成纖維細胞的生長曲線 圖5 不同濃度PRP培養(yǎng)條件下每孔細胞數(shù)
Fig 1 Effect of PRP with different concentration on the proliferation of normal fibroblasts (×40) a. the control group. b. 1% PRP group. c. 5%PRP group. d. 10%PRP group. Fig 2 Effect of PRP with different concentration on the proliferation of photoaging fibroblasts (×40). a. the control group. b. 1% PRP group. c. 5%PRP group. d. 10%PRP group. Fig 3 Effect of PRP on the proliferation and form of photoaging fibroblasts (×100). Fig 4 Growth curve of normal fibroblasts at different PRP concentrations. Fig 5 Number of cells in each well at different PRP concentrations.

3 討論

皮膚的光老化是外源性老化的主要形式，在皮膚的光老化進程中，成纖維細胞在形態(tài)與功能的改變起著重要的作用。PRP的構(gòu)成具有特定的生物學比例，被認為是極具開發(fā)潛力的生長因子庫。PRP被廣泛應(yīng)用于骨科、口腔科、胸外科以及整形美容等領(lǐng)域[6-11]。由于PRP取材簡單，自體應(yīng)用時不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，將其應(yīng)用于光老化的研究具有極大的可嘗試性。在該實驗中我們發(fā)現(xiàn),對于正常的成纖維細胞一定濃度范圍內(nèi)的PRP，能夠明顯促進細胞的增殖，這種增殖呈現(xiàn)濃度依賴性。而對于光老化的成纖維細胞，PRP促進細胞增殖表現(xiàn)為兩方面：一方面，低濃度的PRP可以減少光老化引起的細胞凋亡，改善光老化引起的細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化;另一方面，較高濃度的PRP在成纖維細胞光老化的進程中反而會加速光老化細胞的凋亡。

上述實驗結(jié)果提示，RPR在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進正常成纖維細胞的增殖，且對于正常成纖維細胞，即使繼續(xù)增加PRP的濃度也并不會出現(xiàn)像光老化組成纖維細胞表現(xiàn)的肥大鋪展的外觀，這可能是由于PRP對于正常的成纖維細胞主要表現(xiàn)為促進細胞增殖的作用，而并不會出現(xiàn)如實驗組中因增高PRP濃度而導(dǎo)致細胞凋亡的現(xiàn)象。因為研究證明，只有在光老化的成纖維細胞中才會高度表達TGF-β及其受體，且后者的表達與衰老表型相關(guān)[12]。而在光老化的成纖維細胞中，由于紫外線的照射對成纖維細胞產(chǎn)生的直接和間接損傷作用，因而引起細胞的衰老甚至凋亡；而適宜濃度的PRP能夠改善光老化細胞的這種損傷，減少細胞的凋亡。較高濃度的PRP，光老化過程中的成纖維細胞之所以能起到一個加速其細胞凋亡的作用，這可能是由于紫外線引起細胞的衰老，會過度表達TGF-β1[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在UVB誘導(dǎo)的人真皮成纖維細胞中，TGF-β1的基因表達水平明顯增高，在加入了TGF-β1受體拮抗劑的實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1受體拮抗劑組能夠降低與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的染色陽性率。此外,該因子表達的增加會引起許多與衰老相關(guān)的基因表達，如p53、p21。而在加入了該因子的拮抗劑后，能夠明顯降低衰老基因的表達。這提示我們在光老化的真皮成纖維細胞中會高表達TGF-β1因子，該因子可能會促進衰老的進程。而PRP中含有豐富的TGF-β因子，在光老化的成纖維細胞中，會通過TGF-β因子相關(guān)通路加重UVB對真皮成纖維細胞的損傷。這可能是較高濃度PRP引起光老化細胞過度凋亡的原因。從上述結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),適宜濃度的PRP能夠改善成纖維細胞的光老化進程，減少其凋亡，但過高濃度的PRP會促進細胞的凋亡。

然而，適宜濃度的PRP如何調(diào)節(jié)光老化皮膚的進展，并改善其衰老狀態(tài)，以及如何在臨床實際應(yīng)用中尋找到一個合適的來源于自體的PRP濃度，并將其應(yīng)用于自身光老化皮膚的治療，仍需要進一步研究。

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Effect of platelet-rich plasma on the proliferation of photoaging skin fibroblasts

JIAChuan-long,CHENLiang,YANGQing-jian,BIBo,LUYong-zhou,GUYu,ZHUJing-jng,ZHUNing-wen,LIUTian-yi.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

LIUTian-yi,E-mail：tianyiliucn@126.com

Objective To discuss the effect of platelet-rich plasma (PRP) with gradient concentrations on the proliferation of photoaging skin fibroblasts. Methods PRP was prepared by using two-step centrifugation. The photoaging model was established in mouse dermis by ultraviolet irradiation in vitro. The proliferation of normal fibroblasts and photoaging fibroblasts at different PRP concentrations were observed by using inverted phase contrast microscope. Growth curve of normal fibroblasts at different PRP concentrations measured by cck-8 method. Cell number was counted by cell counter at different periods. Results The number of normal fibroblasts at 1%, 5% and 10% concentration PRP were more than that in the negative control. The number of photoaging fibroblasts at 1% PRP increased, the number of apoptosis cells decreased while the number of photoaging fibroblasts at 5% and 10% PRP decreased, the number of apoptosis cells increased. Conclusion Within a certain range of concentrations of PRP, normal fibroblast cells promote cell proliferation, and this effect is dose-dependent. However, the photoaging fibroblasts showed different results. On the one hand, PRP at low concentration reduced cell apoptosis and increased the number of cells; on the other hand, PRP at high concentration accelerated the apoptosis and lower cell numbers of photoaging fibroblasts.

Platelet-rich plasma; Dermis; Fibroblasts; Photoaging; Cell proliferation

上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人資助項目(XBR2011033)；國家自然科學基金(81272125;81301642)；國家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃(863)項目(SS2014AA020705)

200040，上海，復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院 (整形外科：賈傳龍，陳 亮，楊清建，畢 波，盧勇周，郭 妤，朱晶晶，劉天一；皮膚科：朱寧文)

賈傳龍(1989-)，男，山東棗莊人，碩士研究生.

劉天一，200040，復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.015

R-322

A

1673-7040(2016)04-0234-04

2015-10-24)