于 莉，吳 璇，汪旻旻，黃升海

◇經(jīng)驗與體會◇

呼吸道合胞病毒空斑形成實驗的條件優(yōu)化

于 莉，吳 璇，汪旻旻，黃升海

采用空斑形成實驗方法測定呼吸道合胞病毒（RSV）的滴度，加入覆蓋層倒置培養(yǎng)27、30、34、40 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層后，可見清晰透明空斑，邊緣清晰、形態(tài)均為圓形或類圓形，空斑直徑分別為1、1.5、3、5 mm左右。加入覆蓋層后培養(yǎng)病毒的時間可以影響RSV最終所形成的空斑大小，并且隨著時間的延長空斑逐漸增大，在30～34 h所形成的空斑大小最佳，易于計數(shù)。病毒的稀釋度也會影響空斑最終形成的數(shù)量，且隨著稀釋度的增加，空斑數(shù)量逐漸減少。關鍵詞 呼吸道合胞病毒；空斑形成實驗；甲醛-結晶紫

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呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）被認為是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴重下呼吸道感染最常見的病原體，也是引起免疫力低下患者和老年人下呼吸道感染的病原體之一［1-3］。因此RSV越來越受到重視，而對RSV致病機制的研究及抗RSV藥物和疫苗的研發(fā)均需對RSV的滴度進行定量測定。國內(nèi)外通常采用空斑計數(shù)對病毒進行滴度檢測。該實驗采用甲醛-結晶紫空斑法在原有的空斑形成實驗方法上［4-5］，通過對營養(yǎng)覆蓋物培養(yǎng)時間的改變，就RSV在人喉癌上皮細胞（human larynx carcinoma epithelial cell，Hep-2）上在培養(yǎng)時間及病毒稀釋度改變的條件下所形成空斑的大小及數(shù)量進行研究，進而進行條件優(yōu)化。擬達到相對較好的實驗條件，能夠更精確地對病毒滴度進行檢測，并且重復性相對較好，為臨床病程的判斷提供更準確的參考信息。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒 Hep-2細胞為人喉癌上皮細胞，RSV為國際標準株Long株，以上均由安徽醫(yī)科大學微生物學教研室保存。

1.2 主要試劑 新生牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；瓊脂糖（上海生工生物工程股份有限公司）；6孔細胞培養(yǎng)板（中國Nest Biotechnology公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)及病毒增殖 用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Hep-2細胞，長至80%時，用0.25%胰酶消化傳代；將細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后接種至細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至60%～70%融合時，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，取10 m l RSV加入Hep-2細胞中，37℃、5%CO2條件下孵育，15～30 min搖晃1次；2 h后，棄去上清液，加入含3%新生牛血清的DMEM病毒維持液10 ml，37℃、5% CO2條件下孵育；至Hep-2細胞典型融合病變達90%～100%時，將細胞刮下，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液分裝后凍于-80℃或液氮罐中備用。

1.4 空斑形成實驗 實驗過程：①以5.0×105的密度接種Hep-2細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其24 h內(nèi)長成單層；②在冰盤上用DMEM將RSV作10倍連續(xù)系列稀釋（圖1），即在一系列2 ml的EP管中先加入1.8 m l DMEM，取0.2ml RSV加入第一支Ep管中，充分混勻后的該RSV病毒懸液的稀釋度為10-1，取混合后的0.2 ml病毒懸液加入第二支EP管中，該管中的病毒稀釋度為10-2，依此類推作系列稀釋，則得到連續(xù)10倍稀釋的病毒懸液。隨著稀釋度的增加，病毒的毒力逐漸減弱；③棄去細胞培養(yǎng)板中各孔中的培養(yǎng)液，取稀釋度為10-7～10-11的病毒懸液1 ml加入培養(yǎng)板中，剩下1孔不加病毒僅加入1 ml的DMEM作為正常對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附3 h，期間每15～30 min搖動1次，以保證病毒分布均勻；④棄去各孔中的病毒液，用PBS輕輕洗滌3次。每孔加入3 ml的營養(yǎng)瓊脂覆蓋層（含5%新生牛血清的 2×DMEM與1%瓊脂糖等體積混勻），新生牛血清的終濃度為2.5%，瓊脂糖為0.5%。室溫下水平放置15 min使其凝固；⑤置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別培養(yǎng)27、30、34、40 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入2 ml含甲醛的結晶紫固定過夜。次日剔除覆蓋層，用自來水輕輕沖洗后即可觀察到清晰的空斑。

圖1 RSV作10倍連續(xù)系列稀釋

2 結果

加入營養(yǎng)瓊脂覆蓋層分別倒置培養(yǎng)27、30、34、40 h后，每孔加入2 ml含4%甲醛的結晶紫溶液固定染色。結果可見，加入覆蓋層后培養(yǎng)27 h，進行固定染色過夜，剔除覆蓋層，用自來水輕輕沖洗后可觀察到直徑約1 mm、形態(tài)為圓形或者類圓形的空斑，邊緣整齊，清晰透明；且隨著病毒稀釋度的增加，空斑的數(shù)量逐漸減少。該培養(yǎng)時間點所形成的空斑面積較小，不易于計數(shù)（圖2）。培養(yǎng)30 h及34 h的細胞培養(yǎng)板剔除覆蓋層后，可觀察到比27 h的空斑略大，直徑分別約為1.5和3 mm，該時間段內(nèi)形成的空斑較易于觀察計數(shù)，且空斑的數(shù)量亦隨著病毒的稀釋逐漸減少（圖3～4）。而培養(yǎng)40 h后則觀察到直徑為5 mm左右的大空斑，不易于計數(shù)，空斑形成的數(shù)量與病毒的稀釋程度呈反比（圖5）。

圖2 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)27 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

3 討論

RSV是嬰幼兒細支氣管炎和病毒性肺炎的最重要原因，在嬰幼兒中有較高的發(fā)病率及死亡率，而且可以引起中耳炎及呼吸暫停等一系列疾病［3，6］。在全球不同地區(qū)統(tǒng)計每年因RSV感染死亡的人數(shù)高達16萬，而因并發(fā)RSV感染死亡的人數(shù)近60萬［7］。因此，檢測、預防和治療RSV感染的研究非常重要。而在進行上述RSV相關基礎研究時，首先要對RSV病毒的滴定進行測定。

圖3 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)30 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

圖4 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)34 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

由于RSV是RNA病毒，屬于副黏病毒屬，對其進行病毒滴度的測定比DNA病毒更難。此前也有學者用免疫法測定 RSV滴度，但是一旦RSV融合（F）蛋白發(fā)生突變，抗F蛋白的單克隆抗體就會失效，從而導致空斑實驗失?。?］。而傳統(tǒng)的病毒空斑技術操作較繁雜，影響病毒空斑形成的因素較多，且用中性紅染色的標本不能固定保存［9］。針對這些問題本研究采用甲醛-結晶紫空斑法對RSV進行空斑形成實驗的研究。甲醛-結晶紫空斑法是利用病毒感染細胞后形成一個局限性的病變細胞區(qū)，由于結晶紫是堿性染料，可以與細胞核中的核酸結合，把核染成紫色。正常細胞經(jīng)結晶紫染色后呈紫色，經(jīng)甲醛作用固定于培養(yǎng)板上。而病毒感染所致病變的細胞則不能固定，被自來水沖掉形成空斑，肉眼可見圓形或類圓形斑。理論上一個最初感染細胞的病毒顆粒形成一個空斑，經(jīng)結晶紫染色后即可直接肉眼觀察、計數(shù)空斑，精確測定病毒感染單位量［10］。

圖5 加入覆蓋層倒置培養(yǎng)40 h后經(jīng)固定染色、剔除覆蓋層所形成的空斑A：空白對照；B～F：病毒稀釋度分別為　10-7～10-11

應用此法測定RSV滴度簡便易行、耗時短、成本低，能準確測定病毒的滴度，還可保留實驗結果，并且重復性好，具有較高的穩(wěn)定性［9］。但是影響空斑形成的因素有很多，本研究主要檢測了在其他條件不變的情況下，培養(yǎng)時間及病毒毒力變化對空斑大小及其數(shù)量的影響。研究顯示，RSV空斑形成實驗中，感染RSV后加入覆蓋層培養(yǎng)病毒的時間可以影響RSV最終所形成的空斑大小，并且隨著時間的延長空斑逐漸增大。在加入覆蓋層后培養(yǎng)感染RSV的Hep-2細胞30～34 h，得到的空斑清晰且易于計數(shù)；而且隨著病毒的毒力減弱，空斑的數(shù)量逐漸減少。該條件下得到的空斑敏感性更高、定量更精確，且重復性好，能夠為臨床病程的判斷提供更準確的參考信息，更好地為臨床服務。

本實驗中只對RSV病毒的空斑形成實驗做了條件優(yōu)化，沒有以其他的病毒作為對照；另外也只做了不同培養(yǎng)時間和病毒稀釋度這兩個方面的影響因素，對瓊脂糖濃度等條件并沒有進行探討，有待進一步完善。

［1］ Nair H，Nokes D J，Gessner B D，et al.Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children：a systematic review and meta-analysis［J］.Lancet，2010，375（9725）：1545-55.

［2］ Hall C B.Respiratory syncytial virus in young children［J］.Lancet，2010，375（9725）：1500-2.

［3］ 朱童娜，吳 璇，邱 歡，等.呼吸道合胞病毒感染人肺上皮細胞誘導氧化應激對TLR7基因及其下游因子表達的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2014，49（11）：1539-43.

［4］ Dulbecco R.Production of plaques inmonolayer tissue cultures by single particles ofan animal virus［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，1952，38（8）：747-52.

［5］ McKimm-Breschkin JL.A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaqueswithout immunostaining［J］.JVirol Methods，2004，120（1）：113-7.

［6］ Chen YW，Huang Y C，Ho T H，etal.Viral etiology ofbronchiolitis among pediatric inpatients in northern Taiwan with emphasis on newly identified respiratory viruses［J］.JMicrobiol Immunol Infect，2014，47（2）：116-21.

［7］ 朱傳鳳，傅生芳，寇桂英，等.人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表達和純化［J］.中國生物制品學雜志，2012，25 （4）：389-92.

［8］ Shinoff JJ，O′Brien K L，Thumar B，etal.Young infants can develop protective levels of neutralizing antibody after infection with respiratory syncytial virus［J］.J Infect Dis，2008，198（7）：1007 -15.

［9］ 蔣 虹，喬紅偉，叢 囂，等.SARS-CoV細胞空斑試驗［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19（8）：65-6.

［10］王金華，陳愛歡.甲基纖維素-結晶紫空斑法在呼吸道合胞病毒檢測中的應用［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（23）：10806-8.

Condition optim ization for plaque form ing test of respiratory syncytial virus

Yu Li，Wu Xuan，Wang Minmin，et al
（Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Respiratory syncytial virus（RSV）titerswere investigated by plaque formation assay.Clarity and boundary clear plaques could be visible after fixed dyeing and removed covers after joining covering cultivation 27，30，34，and 40 h.Round or class round plaque morphologies and plaques in 1，1.5，3 and 5 mm diameter were formed in different layer inversion training time，respectively.Plaques size which was formed by RSV could be affected by virus incubation time after added layer and plaques dimensionswere increased gradually with the time extending in the plaque formation assay for RSV.The plaques were easy to be counted during 30～34 h in which the best size and number ofplaques could be detected.The number of plaques formed eventually could also be affected by the dilution of virus and with the increase of dilution degrees，the reduction of plaque quantitieswas observed. Key words respiratory syncytial viruses；plaque forming assay；formaldehyde-crystal violet

R 373.14

A

1000-1492（2016）04-0595-04

2016-01-18接收

國家自然科學基金（編號：81371797）；安徽高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2012A152）

安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室，合肥 230032作者簡介：于 莉，女，碩士研究生；
黃升海，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：huangshh68@aliyun.com