王濤　溫桂?！埞饢|　李恩君　武向鵬　苑昭獎　王杰

(1.邯鄲市中心醫(yī)院普外一科，河北 邯鄲 056001;2.重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400011)

?

N-乙酰半胱氨酸通過抑制HIF-1α下調(diào)肝癌HepG2細胞survivin和VEGF表達的實驗研究*

王濤1溫桂海1張桂東1李恩君1武向鵬1苑昭獎1王杰2

(1.邯鄲市中心醫(yī)院普外一科，河北 邯鄲 056001;2.重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400011)

【摘要】目的探討在低氧環(huán)境下N-乙酰半胱氨酸(NAC)能否通過抑制HIF-1α合成下調(diào)肝癌HepG2細胞survivin和VEGF的表達。方法將肝癌HepG2細胞分為3組，分別為常氧組(Normoxia組)、低氧組(Hypoxia組)和NAC+低氧組(NAC+Hypoxia組)。在低氧環(huán)境下對肝癌HepG2細胞使用NAC進行干預(yù)，在不同時間點(0h、24h和72h)采用MTT法對HepG2細胞的活性進行檢測；同時在干預(yù)24h后，使用qPCR法和western blot法對HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α的mRNA和蛋白水平進行檢測。結(jié)果低氧環(huán)境下肝癌HepG2細胞活性呈時間依賴性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且在各時間點與低氧組細胞相比較NAC+低氧組細胞活性下降更加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在低氧環(huán)境下24h后HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環(huán)境下顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但NAC+低氧組細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較低氧組細胞顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境中N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以通過下調(diào)HIF-1α的合成抑制肝癌HepG2細胞survivin、VEGF的表達，并可有效抑制腫瘤細胞的增殖。該基礎(chǔ)研究為NAC應(yīng)用于腫瘤的臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】N-乙酰半胱氨酸；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；survivin；血管內(nèi)皮生長因子；HepG2細胞

由于腫瘤細胞增殖、分化和生長的無序性和腫瘤血管生成的異常，導(dǎo)致腫瘤特別是實體腫瘤組織內(nèi)部出現(xiàn)不同程度的缺氧[1-5]。目前大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)低氧(hypoxia)或者缺氧環(huán)境可成為誘導(dǎo)和促進腫瘤演進的重要因素[1-6]。并有研究認為缺氧相關(guān)的組織微環(huán)境在包括肝癌、非小細胞肺癌及直結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞的增殖(proliferation)、侵襲(invasion)、分化(differentiation)、轉(zhuǎn)移(metastasis)和腫瘤血管生成(angiogenesis)的過程中扮演著重要的角色[1-6]。同時進一步的實驗發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)對缺氧環(huán)境中的腫瘤細胞的生物學(xué)特性具有重要的調(diào)控作用[1-6]。多個研究表明抑制HIF-1α的表達或活化可以有效抑制多種腫瘤的血管生成和腫瘤細胞的增殖[1-6]。目前實驗發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對結(jié)腸癌等多種實體腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，并認為與抑制HIF-1α的表達密切相關(guān)[7]。本研究的目的是探討在低氧環(huán)境下NAC對于肝癌HepG2細胞的抑制作用及其潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料RNA提取試劑盒和qPCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人VEGF抗體、鼠抗人HIF-1α抗體和鼠抗人β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；N-乙酰半胱氨酸購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小牛血清購自澳大利亞Gibco公司；MTT試劑盒購自美國Promega公司；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)肝癌HepG2細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g/L 青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。HepG2細胞分為常氧組(Normoxia組)、低氧組(Hypoxia組)和低氧+N-乙酰半胱氨酸組(Hypoxia+NAC組)。其中常氧組和低氧組細胞加入PBS，NAC+低氧組加入溶于0.5% DMSO終濃度為40mM的N-乙酰半胱氨酸溶液，而后將低氧組和NAC+低氧組細胞移置于低氧環(huán)境(1% O2、5% CO2和94% N2)進行培養(yǎng)。

1.2.2細胞活性檢測取對數(shù)生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μl約含5×103個細胞。使用MTT比色試驗對NAC干預(yù)后不同時間點(0h、24h和72h)的細胞生長狀態(tài)進行測定，實驗重復(fù)4次。細胞活性(%) = (OD樣本/OD 常氧組0h) × 100 (%)[8]。

1.2.3qPCR法檢測細胞中survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表達檢測干預(yù)24h后，按照qPCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：survivin正義5′-CATGGG TGCCC CGACGTTG-3′，反義5′-GCTC CGGCCAGAGGC CTCAA-3′；VEGF正義5′-TACCTCC ACCATGCCAA GTG-3′，反義5′-ATGATT CTGCCCTC CTCCTTC-3′；HIF-1α正義 5′-CGTTC CTTCGATCA GTTGTC-3′，反義5′-TCAGT GGTGGCA GTGGTAGT-3′；β-actin正義：5′-CATGTAC GTTGCTAT CCAGGC-3′，反義：5′-CTCCTTAATG TCACGCACGAT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉(zhuǎn)錄和擴增實驗。使用2-ΔΔCt法對survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[9]。

1.2.4Western blot法檢測細胞中survivin、VEGF和HIF-1α蛋白表達干預(yù)24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體survivin(1∶1000)、VEGF (1∶1000)、HIF-1α (1∶1000)和β-actin (1∶1200)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，計量資料以均數(shù)±標準差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細胞活性測定比較在低氧環(huán)境中，肝癌HepG2細胞活性隨時間延長而逐漸下降，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且在對應(yīng)時間點與低氧組相比較，NAC+低氧組細胞活性下降更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Table 1Cell viability of HepG2 cells at different time points (0 h,24h,and 72h)

分組 0h24h72hNAC+低氧組101.2±4.262.7±14.5①38.4±16.9①低氧組98.7±3.781.6±8.274.3±11.2

注：與對應(yīng)時間點低氧組相比較①P<0.05

2.2survivin mRNA和蛋白的表達在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下HepG2細胞survivin mRNA和蛋白表達較常氧環(huán)境下顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時與低氧組比較，NAC+低氧組細胞survivin mRNA和蛋白表達相對更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖1。

2.3VEGF mRNA和蛋白的表達在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下HepG2細胞VEGF mRNA和蛋白表達較常氧環(huán)境下顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時與低氧組比較，NAC+低氧組細胞VEGFmRNA和蛋白表達相對更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3和圖2。

表2　肝癌HepG2細胞survivin mRNA的表達

注：與常氧組相比較，①P<0.05，②與低氧組相比較P<0.05

圖1　肝癌HepG2細胞survivin表達的western blot結(jié)果

注：與常氧組相比較①P<0.05，與低氧組相比較②P<0.05

2.4HIF-1α mRNA和蛋白的表達在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下HepG2細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環(huán)境下明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與低氧組比較，NAC+低氧組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達相對更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3和圖2。

圖2肝癌HepG2細胞VEGF和HIF-1α表達的western blot結(jié)果

Figure 2Western blot results of VEGF and HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

3討論

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示在人類最常見的惡性腫瘤中肝細胞癌位居第五位，統(tǒng)計顯示每年的新發(fā)病例數(shù)男性約為52.3萬(占男性惡性腫瘤總發(fā)病人數(shù)的7.9%)，女性約為22.6萬(占女性惡性腫瘤總發(fā)病人數(shù)的6.5%)[10-15]。由于我國是慢性乙型肝炎病毒感染人數(shù)比例較高，也致使我國肝細胞癌的發(fā)病率明顯高于全球平均水平，我國因肝細胞癌死亡的人數(shù)占全球肝細胞癌死亡人數(shù)的50%以上[10-15]。故探索和發(fā)現(xiàn)新的治療肝細胞癌的藥物和方法具有重要的價值和意義。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作為左旋精氨酸的衍生物具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性[16]。NAC是一種含有巰基(-SH)的化合物，其可以通過裂解粘液性分泌物中粘蛋白的二硫鍵(-S-S)誘導(dǎo)粘蛋白分解，有效降低如痰液等分泌物的粘性，促進分泌物的排除。目前多用于急慢性鼻竇炎和慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病的治療[16]。進一步的研究還顯示NAC對于過度的氧化應(yīng)激亦有顯著的抑制作用[16-17]。Xue L等的研究發(fā)現(xiàn)NAC對于微囊藻毒素LR (microcystin-LR)誘導(dǎo)的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster ovary cells,CHO cells)氧化應(yīng)激反應(yīng)有顯著的抑制作用[17]。還有研究證實NAC對包括胃腸道腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生長具有顯著的抑制作用[18-19]。如Lee MF等的研究發(fā)現(xiàn)NAC可以有效抑制人舌鱗狀細胞癌HSC-3細胞和SCC-4細胞的增殖和分化，同時有效下調(diào)腫瘤細胞EGFR/Akt的活化水平[18]。Lee YJ等的研究證實NAC對于前列腺癌PC-3細胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中肝癌HepG2細胞活性隨時間延長而逐漸下降(P<0.05)；且在對應(yīng)時間點與低氧組比較，NAC+低氧組細胞活性下降更明顯(P<0.05)。該實驗結(jié)果表明在低氧環(huán)境下NAC對于肝癌HepG2細胞的增殖有明顯的抑制作用。

缺氧(hypoxia)環(huán)境可直接促進腫瘤細胞向高侵襲性和耐藥性等方向演進。進一步的研究表明該過程與缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的表達密切相關(guān)[8,20]。HIF-1作為一種異二聚體主要受到組織O2的調(diào)控，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基構(gòu)成。在非激活狀態(tài)下(常氧環(huán)境中)細胞內(nèi)的HIF-1α通過E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligases)持續(xù)的誘導(dǎo)并通過泛素化降解；當(dāng)在低氧環(huán)境中時E3泛素蛋白連接酶的活性被抑制，導(dǎo)致HIF-1α與HIF-1β的結(jié)合形成HIF-1α/HIF-1β異二聚體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8,20]。研究顯示HIF-1對包括肝細胞癌和非小細胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的血管生成、分化、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均有重要的調(diào)節(jié)作用，下調(diào)HIF-1的表達和活化對于腫瘤細胞有抑制作用[8,20-21]。如Wei D等的研究發(fā)現(xiàn)地高辛可以通過下調(diào)HIF-1α的合成有效抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和N-Myc downregulated gene 1 (NDRG1)的表達[8]。吳曉慧等通過細胞實驗和移植瘤小鼠實驗證實YC-1對于肝細胞癌SMMC-7721細胞有直接的抑制作用并可下調(diào)腫瘤細胞VEGF的表達，同時發(fā)現(xiàn)該作用機制與抑制HIF-1α的合成密切相關(guān)[21]。Hu Y等在對多發(fā)性骨髓瘤細胞的研究中證實HIF-1α對于survivin的表達具有關(guān)鍵性調(diào)控作用，使用siRNA等方法抑制HIF-1α可有效下調(diào)骨髓瘤細胞survivin的合成[22]。在本實驗中我們對survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達使用qPCR和western blot進行分析后發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境可以顯著增加肝癌HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平。同時還發(fā)現(xiàn)在干預(yù)24h后，NAC+低氧組細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較低氧組細胞顯著下降(P<0.05)。表明NAC對于低氧環(huán)境誘導(dǎo)的肝癌HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α表達有顯著的抑制作用。

4結(jié)論

低氧環(huán)境中N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以通過下調(diào)HIF-1α的合成抑制肝癌HepG2細胞survivin和VEGF的表達水平，并可有效抑制腫瘤細胞的增殖。本基礎(chǔ)研究為進一步NAC應(yīng)用于腫瘤的臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

【參考文獻】

[1]秦姣.缺氧誘導(dǎo)因子-1α與腫瘤關(guān)系的研究進展[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(07):1323-1325.

[2]楊慶強,唐春燕.人結(jié)腸癌細胞HT-29血管生成能力與微缺氧的關(guān)系[J].西部醫(yī)學(xué),2011,23(08):1427-1430.

[3]Unwith S,Zhao H,Hennah L,et al.The potential role of HIF on tumour progression and dissemination [J].Int J Cancer,2015,136(11):2491-503.

[4]王學(xué)華,陳善勤,甘道舉.Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細胞癌中的表達及臨床意義[J].西部醫(yī)學(xué),2011,23(07):1208-1211.

[5]Tang CM,Yu J.Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer [J].J Gastroenterol Hepatol,2013,28(3):401-405.

[6]Semenza GL.HIF-1 mediates metabolic responses to intratumoral hypoxia and oncogenic mutations [J].J Clin Invest,2013,123(9):3664-3671.

[7]尹鵬,胡君,儲著凌,等.低氧環(huán)境地高辛通過抑制HIF-1α下調(diào)結(jié)腸癌HCT 116細胞VEGF表達的實驗研究[J].西部醫(yī)學(xué),2015,27(03):335-337,343.

[8]Wei D,Peng J J,Gao H,et al.Digoxin Downregulates NDRG1 and VEGF through the Inhibition of HIF-1α under Hypoxic Conditions in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells [J].Int J Mol Sci,2013,14(4):7273-7285.

[9]尹鵬,胡君,儲著凌,等.替米沙坦通過上調(diào)PPAR-γ促進結(jié)腸癌SW480細胞TIMP-1表達的實驗研究[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(02):160-162.

[10] 陳京來,郎錦義.原發(fā)性肝細胞癌的早期診斷[J].西部醫(yī)學(xué),2006,18(04):491-493.

[11] 楊紅春,李永,馬海.TP、VEGF在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及與肝癌血管生成的相關(guān)性研究[J].西部醫(yī)學(xué),2012,24(07):1265-1267.

[12] Feng X,Xu R,Du X,et al.Combination therapy with sorafenib and radiofrequency ablation for BCLC Stage 0-B1 hepatocellular carcinoma:a multicenter retrospective cohort study [J].Am J Gastroenterol,2014,109(12):1891-1899.

[13] Lin CL,Chien RN,Yeh C,et al.Significant renoprotective effect of telbivudine during preemptive antiviral therapy in advanced liver cancer patients receiving cisplatin-based chemotherapy:a case-control study [J].Scand J Gastroenterol,2014,49(12):1456-1464.

[14] El-Serag HB.Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,2012,142(6):1264-1273.e1.

[15] 曾愛中,黃愛龍.乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌發(fā)病機制研究進展[J].國際病毒學(xué)雜志,2009,16(01):12-16.

[16] 蔡珊,陳平,張程,等.N-乙酰半胱氨酸對煙霧暴露所致大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2008,31(08):623-624.

[17] Xue L,Li J,Li Y,et al.N-acetylcysteine protects Chinese Hamster ovary cells from oxidative injury and apoptosis induced by microcystin-LR [J].Int J Clin Exp Med,2015,8(4):4911-4921.

[18] Lee MF,Chan CY,Hung HC,et al.N-acetylcysteine (NAC) inhibits cell growth by mediating the EGFR/Akt/HMG box-containing protein 1 (HBP1) signaling pathway in invasive oral cancer [J].Oral Oncol,2013,49(2):129-135.

[19] Lee YJ,Lee DM,Lee CH,et al.Suppression of human prostate cancer PC-3 cell growth by N-acetylcysteine involves over-expression of Cyr61 [J].Toxicol In Vitro,2011,25(1):199-205.

[20] Luo D,Wang Z,Wu J,et al.The role of hypoxia inducible factor-1 in hepatocellular carcinoma [J].Biomed Res Int,2014,2014:409272.

[21] 吳曉慧,王順祥,楊永江,等.YC-1對人肝細胞癌裸鼠移植瘤的影響及其機制[J].腫瘤防治研究,2011,38(08):895-898.

[22] Hu Y,Kirito K,Yoshida K,et al.Inhibition of hypoxia-inducible factor-1 function enhances the sensitivity of multiple myeloma cells to melphalan [J].Mol Cancer Ther,2009,8(8):2329-2338.

基金項目：重慶市衛(wèi)生和計生委中醫(yī)藥科技項目(ZY201402030)

【中圖分類號】R 735.7

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.004

(收稿日期：2015-08-19；編輯：陳舟貴)

N-acetylcysteine inhibits survivin and VEGF expression through down-regulation of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

WANG Tao1,WEN Guihai1,ZHANG Guidong1,et al

(1.Department of The First General Surgery,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,China;2.Department of Respiratory Medicine,Traditional Chinese Medical Hospital of Chongqing,Chongqing 400011,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of N-acetylcysteine (NAC) on survivin and VEGF expression in liver cancer HepG2 cells in hypoxia,and its underlying mechanism.MethodsLiver cancer HepG2 cells were divided into three group,Normoxia group,NAC+Hypoxia group and Hypoxia group.At different time points (0h,24h and 72h),cell viabilities were measured by MTT assay.After 24 hours interventions,survivin,VEGF and HIF-1α mRNA were evaluated by qPCR.Meanwhile,the protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α protein were detected by Western blot.ResultsThe proliferation of liver cancer HepG2 cells under hypoxic conditions was time-dependently reduced by NAC interventions.And we found that hypoxia up-regulated the mRNA and protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α in HepG2 cells.Then,our data also figured out that hypoxia-induced up-regulation of survivin,VEGF and HIF-1α was significantly blocked by NAC.ConclusionNAC reduces survivin and VEGF expression probably through the inhibition of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells in hypoxia.

【Key words】N-acetylcysteine; Hypoxia-inducible factor-1α; Survivin; Vascular endothelial growth factor; HepG2 cells