李朝輝，韓保衛(wèi)，王云帥鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院，河南洛陽　471000

CDX2基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的研究進(jìn)展

李朝輝，韓保衛(wèi)，王云帥
鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院，河南洛陽471000

目的觀察分析CDX2基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的狀態(tài)。方法選取該院在2011年3月—2015年7月期間收治的450例結(jié)直腸鋸齒狀病變患者（136例TSA，122例SSA/P，192例HP），并選取82例正常組織作為對(duì)照組，采用METHYLIGHT方法分析結(jié)直腸鋸齒輪病變中CDX2基因甲基化狀態(tài)，并采用免疫分析法分析CDX2基因的表達(dá)情況，收集相關(guān)的臨床資料，分析CDX2基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的狀態(tài)和相關(guān)因素情況。結(jié)果正常對(duì)照組CDX2基因甲基化率53.38%（44/84），SSA/P組75.41%（92/122），HP組72.97% （140/192），TSA組80.88%（110/136）；HP組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）；TSA組與與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）；SSA/P組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。結(jié)論結(jié)直腸鋸齒狀病變中CDX2基因啟動(dòng)子CpG島中上游區(qū)域基化程度高，蛋白表達(dá)陽性率高，兩者相關(guān)性不強(qiáng)，極少部分甲基化狀態(tài)有可能有誘導(dǎo)CDX2蛋白表達(dá)下調(diào)的作用。

CDX2基因；甲基化狀態(tài)；結(jié)直腸；鋸齒狀病變

［Abstract］Objective To observe the analysis of CDX2 methylation state in colorectal serrated lesions.Methods A total of our hospital in March 2011 during July 2015 from 450 cases of colorectal serrated lesions（136 cases of TSA，122 cases SSA/P，192 cases of HP），and select 82 cases of normal tissues as control group，by METHYLIGHT method analysis of colorectal saw gear changes in the methylation status of CDX2 gene，and the use of immune analysis method to analyze the expression of CDX2 gene，collected the clinical data，analysis of CDX2 gene A Methylation status in colorectal serrated lesions status and relevant factors.Results The normal control group of CDX2 gene methylation rate 53.38%44/84，SSA/P group 75.41%92/122，HP group 72.97%（140/192），TSA group 80.88%（110/136）；HP group and normal control group compared，difference not obvious，does not have statistical significance（P=0.019）.The TSA group and compared with normal control group，the difference is not obvious，does not have statistical significance（P= 0.015）；group SSA/P and normal In the control group compared to the difference has statistical significance（P=0.002）. Conclusion Colorectal serrated lesions CDX2 gene start promoter CpG island in the upstream region based level is high，the protein expression positive rate is high，the correlation is not strong，very small part of the methylation status may have induced down-regulation of CDX2 protein expression，most of the methyl of may along with the age increased.

［Key words］CDX2 gene；Methylation status；Colorectal；Serrated lesions

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是臨床常見的一種惡性腫瘤［1］，據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年結(jié)直腸癌死亡人數(shù)占全部惡性腫瘤的8%，直接威脅到人類的健康與生命安全［2］。2010世界衛(wèi)生組織對(duì)結(jié)直腸癌病變進(jìn)行了更為詳細(xì)的分類，包括增生性息肉（HP），占所有病變的75%以上，廣基鋸齒狀腺瘤/息肉（SSA/P）占鋸齒狀病變的15%～25%［3］，而傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤（TSA）并不常見，占鋸齒狀病變的1%左右［4］。到目前為止，臨床上關(guān)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明完全明了，但是關(guān)于這些基因的甲基化、基因雜合子丟失等異常改變使得鋸齒狀病變的發(fā)生發(fā)展卻取得一定的發(fā)展，并為結(jié)直腸癌的靶向治療提供了有效參考［5］。為此，以該院2011年3月—2015年7月期間收治的450例結(jié)直腸鋸齒狀病變患者作為研究對(duì)象，取得了不錯(cuò)的效果，具體報(bào)道結(jié)果如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取我院在2011年3月—2015年7月期間收治的450例結(jié)直腸鋸齒狀病變患者，男240例，女210例，年齡28～59歲，平均年齡（39.6±5.1）歲；其中，136例TSA，男78例，女78例，年齡28～59歲，平均年齡（39.8±4.9）歲；122例SSA/P，男62例，女60例，年齡28～59歲，平均年齡（39.7±5.5）歲；192例HP，男100例，女92例，年齡28～59歲，平均年齡（39.6±5.1）歲；并選取82例正常組織作為對(duì)照組，男42例，女40例，年齡28～59歲，平均年齡（39.2±5.3）歲；各組之間臨床資料基數(shù)對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)

該研究所有患者均經(jīng)過直腸息肉和腺瘤切睡篩選出腺體具有鋸齒狀特征的息肉及腺瘤，所有患者均進(jìn)行組織學(xué)診斷和分類；均由3名病理醫(yī)師按照WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)確診。

1.3方法

回顧分析450例結(jié)直腸鋸齒狀病變患者（136例TSA，122例SSA/P，192例HP）的臨床資料，并選取82例正常組織作為對(duì)照組，提取研究對(duì)象組織DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，采用METHYLIGHT方法（TAQMAN探針）分析結(jié)直腸鋸齒輪病變中CDX2基因甲基化狀態(tài)，并采用免疫分析法分析CDX2基因的表達(dá)情況，收集相關(guān)的臨床資料，分析CDX2基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的狀態(tài)和相關(guān)因素情況。

1.3.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 離心機(jī)（ANDYBIO）、生物安全柜、電熱恒溫水浴鍋（DK-S24）、熒光定量PCR、超微量分光光度計(jì)（NANODROP）、渦旋震蕩器（XW-80A）、顯微照相鏡（OLYMPUSBX40）、SC202-00型70度熱恒溫干燥箱、載玻片和蓋玻片等。CDX2抗體（克隆號(hào)CDX-88）、DBA顯色試劑盒。

1.3.2實(shí)驗(yàn)方法 按照DNA提取試劑盒的操作步驟，將蠟塊切成厚切片，連切5張，放入裝有1 mL二甲苯的EP管中，劇烈震蕩，離心分離，將不清液移除，重復(fù)4次，加入1 mL酒精，濃度100%，震蕩搖勻，室溫下離心分離，將管口打開，待殘留的酒精全部蒸發(fā)，然后加入緩沖液、蛋白酶K、渦旋混勻，直到樣品完全溶解，孵育1 h。然后再離心分離，提取所需要的DNA，將DNA樣品置于零下20°的冰箱中保存。測(cè)量DNA純度，用亞酸氫鈉修飾，測(cè)序、免疫組織化學(xué)染色，判定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

正常對(duì)照組CDX2基因甲基化率53.38%（44/ 84），SSA/P組 75.41%（92/122），HP組 72.97%（140/ 192），TSA組80.88%（110/136）；HP組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）；TSA組與與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）；SSA/P組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

表1　正常對(duì)照組和SSAP組CDX2基因甲基化率比較（%）

表2　正常對(duì)照組和HP組CDX2基因甲基化率比較（%）

表3　正常對(duì)照組和TSA組CDX2基因甲基化率比較（%）

3　討論

結(jié)直腸癌是常見的消化系惡性腫瘤［6］。近年來研究表明，結(jié)直腸的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，主要原因就是人們?nèi)狈?duì)直腸癌鋸齒病變的認(rèn)識(shí)［7］。世界衛(wèi)生組織（WHO）對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤在2010年也進(jìn)行了一些修正，但是并沒有關(guān)于HP的明顯變化，而是對(duì)TSA進(jìn)行了嚴(yán)格的界定［8］。最近越來越多研究證明，鋸齒狀病變的惡變潛能高于傳統(tǒng)的息肉/腺瘤。

據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年結(jié)直腸癌死亡人數(shù)占全部惡性腫瘤的8%，直接威脅到人類的健康與生命安全。2010世界衛(wèi)生組織對(duì)結(jié)直腸癌病變進(jìn)行了更為詳細(xì)的分類，包括增生性息肉占所有病變的75%以上，廣基鋸齒狀腺瘤/息肉，占鋸齒狀病變的，而傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤并不常見，占鋸齒狀病變的1%左右。

有研究表明，鋸齒狀病變發(fā)生和惡變的過程是一個(gè)連續(xù)多階段、多因素、多基因改變的漸進(jìn)性和錯(cuò)綜復(fù)雜的累積過程［9］。在鋸齒狀病變演變過程中，涉及多種癌基因，這些基因的改變，也導(dǎo)致鋸齒狀病變的特殊結(jié)構(gòu)［10］，同時(shí)，基因表達(dá)在發(fā)生著可遺傳性的變化，如染色體重塑、DNA甲基化等［11］，其中，DNA甲基化修飾異常與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，其會(huì)導(dǎo)致癌基因沉默，使病變迅速發(fā)展為癌［12］，因此，若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)鋸齒狀通路中的異常的DNA甲基化，就可以獲取結(jié)直腸癌的早期診斷和高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物［13］。如在本次研究中，其結(jié)果顯示:正常對(duì)照組CDX2基因甲基化率53.38%（44/84），SSA/P組 75.41%（92/122），HP組72.97%（140/192），TSA組80.88%（110/136）；HP組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）；TSA組與與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.005）；SSA/P組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；說明從HP到SSA的演變過程中，通過DNA甲基化來確診鋸齒狀病變的息肉-腺瘤進(jìn)展，運(yùn)用CPG和MSP檢測(cè)的17個(gè)基因以及引物，發(fā)現(xiàn)不伴有異型增生的SSA檢測(cè)到CDX2甲基化，但是HP沒有檢測(cè)到上述基因甲基化，且在研究中發(fā)現(xiàn)，CPG島甲基化還可能是一個(gè)早期事件，通過CDX2基因的甲基化檢測(cè)能夠?yàn)闇?zhǔn)確檢測(cè)直腸鋸齒狀病變發(fā)生癌變提供有效指導(dǎo)。這也與一些文獻(xiàn)資料研究結(jié)果一致［14-15］。

總而言之，到目前為止，臨床上關(guān)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明完全明了，但是關(guān)于這些基因的甲基化、基因雜合子丟失等異常改變使得鋸齒狀病變的發(fā)生發(fā)展卻取得一定的發(fā)展，并為結(jié)直腸癌的靶向治療提供了有效參考。結(jié)直腸鋸齒狀病變中CDX2基因啟動(dòng)子CpG島中上游區(qū)域基化程度高，蛋白表達(dá)陽性率高，兩者相關(guān)性不強(qiáng)，極少部分甲基化狀態(tài)有可能有誘導(dǎo)CDX2蛋白表達(dá)下調(diào)的作用。CDX2基因甲基化的檢測(cè)為結(jié)直腸鋸齒狀病變的早期診斷提供了用的生物學(xué)標(biāo)志，對(duì)于結(jié)直腸鋸齒狀癌前病變的早期診斷有一定的臨床價(jià)值和指導(dǎo)意義。

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Research Progress of Methylation Status of CDX2 Gene in Colorectal Serrated Lesions

LI Chao-hui，HAN Bao-wei，WANG Yun-shuai
Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang，Henan Province，471000

R735.3

A

2096-1782（2016）06-0062-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.062

李朝輝（1977.11-），男，河南洛陽人，研究生，副主任醫(yī)師，研究方向:胃腸道腫瘤。

王云帥（1985.12-），男，河南鶴壁人，研究生，住院醫(yī)師，研究方向:結(jié)直腸腫瘤，E-mail∶wangyunshuai2134@126.com。

2016-02-26）