李春梅，王馨，周立群，康立勛，李海清，馬晟利.黑龍江省醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱　5000；.黑龍江省醫(yī)院產(chǎn)科，黑龍江哈爾濱　5000

淫羊藿苷對高糖培養(yǎng)條件下大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨能力的影響

李春梅1，王馨1，周立群2，康立勛1，李海清1，馬晟利1
1.黑龍江省醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江省醫(yī)院產(chǎn)科，黑龍江哈爾濱150001

目的探討淫羊藿苷對高糖培養(yǎng)條件下大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨能力的影響。方法選取2015年6月—2016年4月黑龍江省醫(yī)院實驗室的8只大鼠，實驗分組（每個基因進(jìn)行5個復(fù)孔平行實驗）:正常組（2%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞），高糖組（2%胎牛血清+高糖-DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞），淫羊藿苷組1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞），淫羊藿苷組2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞），每組進(jìn)行5個復(fù)孔平行實驗。熒光定量測定成骨相關(guān)基因BMP2、OPN、BSP基因的表達(dá)。結(jié)果淫羊藿苷組1（1.78±0.10）與其它組比較:BMP2（1.37±0.04）、OPN（1.38±0.09）、BSP（1.50±0.05）基因的表達(dá)均高于其相應(yīng)的對照組（P＜0.05）。結(jié)論淫羊藿苷對高糖培養(yǎng)條件下大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨能力有加強作用。

淫羊藿苷；高糖；骨髓基質(zhì)細(xì)胞

［Abstract］Objective To investigate the effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells induced by high glucose in rats under high concentration of glucose.Methods Selected June 2015-2016 in April in Heilongjiang Province Hospital Laboratory of 8 rats，experimental groups（each gene of five hole complex parallel experiment）∶normal group（2%FBS DMEM culture cells），high glucose group（2%fetal bovine serum+glucose of both cultured cells），icariin group 1（2%fetal bovine serum DMEM+icariin cultured cells）and icariin group 2（2%fetal bovine serum and high glucose increased+icariin cultured cells），every five holes in parallel experiments.The expression of BMP2，OPN and BSP genes in the bone related genes was determined by fluorescence quantitative.Results Compared with other groups，the expression of BMP2（1.37±0.04），OPN（1.38±0.09）and BSP（1.50±0.05）genes in the group of 1（1.78±0.10）and other groups was higher than that in the control group（P＜0.05）.Conclusion The effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells of rats under high glucose condition was enhanced by the high concentration of glucose in the rat bone marrow stromal cells.

［Key words］Icariin；High glucose；Bone marrow stromal cells

當(dāng)人類社會日益發(fā)展并逐漸趨向老齡化時，人類患糖尿病的幾率也日漸呈上升趨勢，而該疾病會導(dǎo)致多種并發(fā)癥，進(jìn)而對患者健康造成極大影響。在由糖尿病引發(fā)的各種并發(fā)癥中，骨質(zhì)疏松是其較為常見的，且屬于一種慢性疾病，因此會讓患者長時間承受病痛，也會造成相關(guān)的功能障礙，而且還有致殘的可能，且?guī)茁室绕渌芏嘞嚓P(guān)疾病都高［1］。糖尿病引起的骨質(zhì)疏松近年來日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。淫羊藿苷（Herba epimedii）是一種傳統(tǒng)的補益中藥，其性味辛、甘、溫。體現(xiàn)出強筋骨，補腎陽，祛風(fēng)濕等各方面的作用。在臨床上被廣泛用于骨折、骨代謝相關(guān)的多種疾病的治療中，已取得了顯著的療效［2］。骨形成蛋白2 （BMP2）在骨骼系統(tǒng)的早期發(fā)育過程中有著廣泛的參與，無論是牙胚、心腦等關(guān)鍵臟器的形成，還是附件骨等的發(fā)育，都有著起到了重要的影響作用［3］。對成骨細(xì)胞的黏附過程和礦化的結(jié)束過程起著重要作用的就是骨橋蛋白（OPN）。骨涎蛋白（BSP）在骨礦化中扮演重要的角色，這主要是由它的時空特點體現(xiàn)的，因為它的表達(dá)主要在礦化組織［4］。

該課題通過探討淫羊藿苷在高糖培養(yǎng)環(huán)境下，于2015年6月—2016年4月在黑龍江省醫(yī)院實驗室8只大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨能力的影響，為淫羊藿苷治療糖尿病引起的骨病提供理論基礎(chǔ)并開辟新的思路。

1　實驗材料與方法

1.1材料及設(shè)備

1.1.1材料 取100 g左右3個月健康雄性SD大鼠（黑龍江省醫(yī)院動物飼養(yǎng)室提供）8只，頸椎脫臼處死。傳三代培養(yǎng)，獲得頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞［4］。

1.1.2試劑Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（20151221，0.5 mmol/L，武漢），高純總RNA快速提取試劑盒（2015 1221，0.5 mmol/L，武漢），RNase固相清除劑（20152123，0.01mmol/L，武漢）Powder瓊脂糖（20154211，0.6mmol/L，武漢）50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix（201519876，0.5 mmol/L，武漢）。

1.1.3儀器超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀，K1000），微量移液器（BIOHIT，s120），真空干燥箱（SYSBERY，100），紫外分光光度計（Thermo，p900），熒光定量PCR儀（BION EER，TR232）

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組正常組（2%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞），高糖組（2%胎牛血清+高糖-DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞），淫羊藿苷組1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞），淫羊藿苷組2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞）每組進(jìn)行5個復(fù)孔平行實驗。

1.2.2總RNA提取 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.3實時熒光定量分析 反應(yīng)體系如下。

cDNA模板1 μL

上下游引物（10 μM）各0.5 μL

SYBR GREEN mastermix10 μL

用ddH2O補足至20 μL

反應(yīng)條件如下。

該實驗利用韓國BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量儀進(jìn)行熒光定量分析。

1.2.4分析方法 RNA提取:按照實驗方法中的步驟進(jìn)行RNA提取，并利用紫外分光光度計對提取的RNA濃度進(jìn)行測定。RNA濃度見樣本信息表。實時熒光定量分析如下。

①分析方法∶本實驗分析方法利用2-△△CT方法。

②結(jié)果∶熒光定量分析儀得到的數(shù)據(jù)見附表（本實驗每種樣本每個基因進(jìn)行5個復(fù)孔平行實驗，實驗數(shù)據(jù)的選取，是舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實驗保留數(shù)據(jù)）。利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)見附表。

③統(tǒng)計分析方法:選用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采取的數(shù)值格式為（Mean±SD），以正常組為參照組數(shù)值為1，以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計均經(jīng)SPSS 13.0軟件統(tǒng)計完成，采取3次獨立實驗的單因素方差分析（*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.001）。

2　結(jié)果

2.1熒光定量檢測實驗測定結(jié)果

BMP2熒光定量結(jié)果見圖1，OPN熒光宣結(jié)果見圖2，BSP熒光宣結(jié)果見圖3。

圖1　BMP2熒光定量結(jié)果

圖2　OPN熒光定量結(jié)果

圖3　BSP熒光定量結(jié)果

熒光定量結(jié)果顯示，淫羊藿苷組1BMP2、OPN和BSP基因表達(dá)明顯高于其它組，淫羊藿苷組2基因表達(dá)高于高糖組和正常組，說明，淫羊藿苷增強高糖環(huán)境下頜骨BMCs的成骨能力。

3　討論

糖尿病可引發(fā)骨代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致多種糖尿病骨病（比如，骨量下降、骨折率上升等）。如上文所述，口腔骨丟失會對患者產(chǎn)生兩種重要影響，其一為牙齒存留，其二為義齒修復(fù)。此外，糖尿病可引發(fā)牙槽骨喪失，還會導(dǎo)致粘膜損傷，所以患者往往都對修復(fù)治療無法忍受［5］。當(dāng)糖尿病患者人數(shù)逐漸上升，而相關(guān)醫(yī)療水平也日益提升時，糖尿病治療亦日趨復(fù)雜化。近年來的相關(guān)研究表明，糖尿病與牙周病二者之間存在一種雙向調(diào)節(jié)關(guān)系。根據(jù)大量科學(xué)數(shù)據(jù)可知，當(dāng)人發(fā)生急性感染后，其內(nèi)分泌狀態(tài)以及其代謝狀態(tài)都會發(fā)生變化，因此血糖控制很差，所以牙周感染會對糖尿病患者造成影響，使其無法很好地控制血糖［6］。有鑒于此，糖尿病治療應(yīng)注重牙周病的防治，否則可增加治療難度。但在現(xiàn)實生活中，口腔醫(yī)生對于糖尿病所引發(fā)的口腔并發(fā)癥往往是較為忽視的。此外，對于糖尿病患者而言，維護(hù)口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科醫(yī)生不能充分重視這一點，那么口腔健康也無法得到保障［7］。不過，對糖尿病患者口腔疾病的診療維護(hù)需要有足夠的糖尿病知識作后盾，而口腔科醫(yī)生在這方面最為欠缺，這些都是亟待解決的。

淫羊藿苷是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥最常用的藥物之一，大量臨床治療證明了該藥物的效果。作為淫羊藿的精華部分，淫羊藿苷在近年來被廣泛的應(yīng)用于成骨、破骨細(xì)胞的干預(yù)研究中［8］?，F(xiàn)有的研究成果顯示，淫羊藿苷在臨床應(yīng)用過程中能夠有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)育和增殖。淫羊藿是一種藥用植物，可歸入小檗科淫羊藿屬的范疇，是我國醫(yī)學(xué)常用的傳統(tǒng)補益中藥［9］。根據(jù)《本草綱目》可知，這一味中藥有多種功效，比如祛濕補腎、強心益精、強筋健骨，等等。在臨床上，這味中藥常用于骨折治療，以及多種骨代謝相關(guān)疾病的治療，且具有很不錯的療效。通過相關(guān)研究結(jié)果可知，這味中藥具有諸多藥理活性，包括提高免疫力、抑制癌癥細(xì)胞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高性腺功能、延緩機(jī)體衰老進(jìn)程、以及對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有益影響等等。這味中藥之所以具有如此重要的藥用價值，都?xì)w功于其有效活性成分，也就是一種黃酮類化合物——淫羊藿苷。這種物質(zhì)是一種結(jié)晶粉末，外觀呈淡黃色針狀，很難在水中溶解，但卻能在乙醇中溶解，也能在乙酸乙酯中溶解［10］。

該實驗研究表明，高糖可以導(dǎo)致大鼠BMCs成骨相關(guān)基因表達(dá)下降（包括BMP2，BSP，OPN）由于成骨相關(guān)基因表達(dá)和ALP活性是成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)記，細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成是成骨細(xì)胞晚期分化標(biāo)記，所有實驗結(jié)果說明高糖抑制了BMCs向成骨細(xì)胞的早期和晚期分化，當(dāng)在高糖環(huán)境下加入淫羊藿苷后，相關(guān)基因表達(dá)增強（包括BMP2，BSP，OPN），與馬曉妮等人對成骨細(xì)胞的分化研究結(jié)果一致［11］。

BMP2，OPN，BSP和Runx2作為成骨能力評定指標(biāo)，一般在BMCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，伴隨著全部或者部分的表達(dá)升高［12］。通常的研究會選取以上的幾個指標(biāo)作為判定細(xì)胞成骨能力及是否向BMCs分化的指標(biāo)。該實驗選取了以上這些成骨相關(guān)基因，通過熒光定量的方法檢測，淫羊藿苷組1的BMP2，OPN，BSP和Runx2的表達(dá)均明顯高于其它組，淫羊藿苷組2基因表達(dá)高于高糖組和正常組，說明，淫羊藿苷能增強高糖環(huán)境下BMCs的成骨能力，這與謝曉偉等人研究的干細(xì)胞的成骨分化結(jié)果一致［13］。

由以上可知，淫羊藿苷增強高糖環(huán)境下頜骨BMCs的成骨能力。但其具體通路機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］史曉治，趙詠芳，郭海玲.骨碎補總黃酮與淫羊藿苷對人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及蛋白表達(dá)的影響 ［J］.中醫(yī)學(xué)報，2015（5）∶693-695.

［2］訾慧，李可強，鄭洪新.補腎壯骨滴丸中淫羊藿苷在骨質(zhì)疏松模型與正常大鼠體內(nèi)組織分布比較 ［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（12）∶2856-2859.

［3］劉童斌，袁月，趙鈺婷，等.載淫羊藿苷緩釋電紡纖維對成骨細(xì)胞影響的實驗研究 ［J］.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（6）∶770-775.

［4］石文貴，李雪雁，陳克明，等.基于cAMP-PKA信號通路的淫羊藿苷促進(jìn)骨形成研究 ［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015，32（2）∶131-136.

［5］史曉治，趙詠芳，郭海玲.骨碎補總黃酮與淫羊藿苷對人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及蛋白表達(dá)的影響 ［J］.中醫(yī)學(xué)報，2015，30（5）∶693-695.

［6］馬小妮，石文貴，謝艷芳，等.淫羊藿苷對體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨性分化的影響［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2015，27（3）∶16-19.

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［8］俞吉，朱裕林，桑冉，等.高效液相色譜法測定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量［J］.實用藥物與臨床，2015，18（6）∶691-693.

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Effect of the Content of the Bone Marrow Stromal Cells of Rat Bone Marrow Stromal Cells under High Glucose Condition

LI Chun-mei1，WANG Xin1，ZHOU Li-qun2，KANG Li-xun1，LI Hai-qing1，MA Sheng-li1
1.Department of Stomatology，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China；2.Department of Obstetrics，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China

R285

A

2096-1782（2016）06-0008-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.008

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才研究專項基金（2014RFQGJ018）。

李春梅（1981-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔內(nèi)科的臨床研究工作。

2016-05-04）