鐘　雋　陳少華　張　濤　郁　志　盧育洪　楊力建　賴　菁　李揚秋

(暨南大學附屬一院血液科，廣州510632)

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ITP病人外周血中T細胞免疫抑制性受體Tim-3、LAG-3和BTLA的表達特點①

鐘雋陳少華②張濤郁志盧育洪楊力建②賴菁李揚秋②

(暨南大學附屬一院血液科，廣州510632)

免疫性血小板減少癥(Immune thrombocyt-openia，ITP)是一種自身免疫性出血性疾病，T細胞免疫調(diào)控在ITP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)了ITP中存在異常的TCR亞家族克隆增殖和TCR信號通路[1，2]。近幾年系列研究發(fā)現(xiàn)ITP的T細胞免疫異常與一些介導免疫耐受的分子表達異常相關[3-5]。T細胞免疫抑制受體在T細胞活化與增殖的負調(diào)控中扮演著重要的角色，這些受體主要包含了PD-1(程序性死亡分子-1)、CTLA-4(細胞毒性淋巴細胞相關抗原 4)、Tim-3(T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3)，LAG-3(淋巴細胞活化基因-3)和BTLA(B和T淋巴細胞弱化子)等[6]。近期已有研究報道顯示ITP病人血清可溶性PD-1和PD-L1表達水平明顯降低，提示該信號通路與疾病的相關性，同樣，CTLA-4突變，多態(tài)性和表達水平的改變也提示與ITP相關[5，7-9]。而未有研究顯示Tim-3、LAG和BTLA等新近報道的免疫抑制分子在ITP中的變化特點。本研究首先分析這些基因在ITP病人外周血中的表達特點。

1材料與方法

1.1樣本資料本研究收集了18例初診ITP病人(男6例，女12例，年齡24～68歲)外周血，病人按照常規(guī)方案資料，其中4例病人為難治ITP。20例健康人(男9例，女11例，年齡：20～50歲)外周血作為對照組。收集各樣本經(jīng)肝素抗凝血后，按常規(guī)方法分離外周血單個核細胞。

1.2方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成RNA 提取應用 TRIzol 試劑盒，并應用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。

1.2.2實時定量PCR應用Real Master Mix試劑盒，利用SYBR GreenⅠ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測。分別利用Tim-3，LAG-3和BTLA基因的引物檢測其表達水平，利用β2微球蛋白(β2M)作為內(nèi)參，所采用引物見表1，其中BTLA基因的引物由Origene(Accession No.NM_001085357,NM_181780)提供( http://www.origene.com/qPCR/primer_pair/HP226238.aspx)[10]。隨機選取每個基因的實時定量PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物片段大小。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以中位數(shù)表示；采用兩樣本秩和檢驗進行數(shù)據(jù)分析；相關性分析采用Spearman等級相關性分析；P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1ITP中Tim-3、LAG-3和BTLA表達特點所檢測的ITP和健康人樣本中，均表達Tim-3、LAG-3和BTLA基因，實時定量PCR的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物片段大小與預期結(jié)果相符合(結(jié)果未顯示)。由于3種基因的表達水平在不同樣本中差異較大，故采用中位數(shù)表示結(jié)果并結(jié)合秩和檢驗比較結(jié)果的統(tǒng)計學意義。在18例ITP中Tim-3基因(中位數(shù)：0.135 2)、LAG-3(中位數(shù)：0.072 3)和BTLA(中位數(shù)：0.140 3)的表達水平均比健康人對照組高，尤其是BTLA基因的表達水平更為明顯。在健康人中，各基因表達水平分別為Tim-3(中位數(shù)：0.075 1)(P=0.007)(圖1A)；LAG-3(中位數(shù)：0.015 5)(P< 0.001)(圖1B)和BTLA(中位數(shù)：0.031 5)(P< 0.001)(圖1C)。此外，4例難治病人與其他14例病人(常規(guī)組)樣本之間各基因的表達水平存在一定的差異，但是結(jié)果沒有統(tǒng)計學意義(表2)。

表1熒光定量RT-PCR引物序列

Tab.1Sequences of primers used in real-time RT-PCR

GeneSequencessize(bp)Tim-3-F5'-AGGGGACATGGCCCAGCAGA-3'179Tim-3-R5'-GCCAGCCCAGCACAGATCCC-3'LAG-F5'-CTAGCCCAGGTGCCCAACGC-3'141LAG-R5'-GCCTGCGGAGGGTGAATCCC-3'BTLA-F5'-TGGGTCATACCGCTGTTCTGCA-3'193BTLA-R5'-CTGCTTGCCATTTCGTCCTTGG-3'β2M-F5'-TACACTGAATTCACCCCCAC-3'145β2M-R5'-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3'

圖1　Tim-3、LAG-3和BTLA在ITP和健康人中的表達水平Fig.1　Expression levels of Tim-3，LAG-3 and BTLA gene in patients with ITP and healthy individuals(HI)Note: ITP Immune thrombocytopenic purpura；HI.healthy individuals

表2不同療效ITP樣本中各基因表達水平比較

Tab.2Comparison of gene expression level in ITP with different response group

GeneExpressionlevel(median)Standardgroup(n=14)Refractorygroup(n=4)PvalueTim-30.1350.1830.671LAG-30.0790.0530.524BTLA0.1390.2160.832

2.2ITP中Tim-3、LAG-3和BTLA表達相關性我們進一步各基因表達水平之間的相關性，結(jié)果顯示，Tim-3、LAG-3和BTLA基因表達水平之間在ITP樣本中的相關性無統(tǒng)計學意義(圖2A-C)，而在健康人對照組中，Tim-3和LAG-3基因的表達水平呈正相關(rs =0.496,P=0.026)(圖2D)，而Tim-3與BTLA和LAG-3與BTLA基因表達水平之間的相關性無統(tǒng)計學意義(圖2E-F)。

圖2　ITP和HI中Tim-3、LAG-3和BTLA基因表達水平的相關性分析Fig.2　Correlation analysis between relative expression level of Tim-3，LAG-3 and BTLA gene in ITP and HINote: A-C.Correlation analysis among Tim-3，LAG-3 and BTLA genes from ITP ; D-F.Correlation analysis between relative expression level of Tim-3，LAG-3 and BTLA genes from HI.

3討論

越來越多研究顯示ITP發(fā)病機制涉及多層面的T細胞介導的免疫異常，包括了T細胞亞群失衡，調(diào)節(jié)性T細胞比例降低、異常T細胞克隆增殖、異常細胞因子分泌、以及一系列涉及T細胞增殖分化調(diào)控基因的異常表達。隨著T細胞免疫耐受研究的進展，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，T細胞免疫抑制受體包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、Tim-3、LAG-3和BTLA等在T細胞活化與增殖的負調(diào)控中起重要作用[6，11]。因此，近期開始有研究分析這些T細胞免疫抑制受體在ITP中的作用。已有發(fā)現(xiàn)ITP病人外周血中PD-1和PD-L1表達顯著降低，這可能是從另一個側(cè)面反映導致病人的免疫耐受程度降低而誘發(fā)自身免疫性病變的新原因之一。而在CTLA-4中的改變特點，主要發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)基因突變和多態(tài)性，某些遺傳學的改變與ITP存在關聯(lián)性，且不同課題組的研究結(jié)果也有所不同[7,9]。而不同病人中這些分子的變化存在差異性，是否存在更多的免疫抑制分子參與ITP的發(fā)病機制，正對這一問題，不斷有新的研究成果，如近期報道了Tim-3、LAG-3和BTLA等系列的T細胞免疫抑制分子，他們在腫瘤免疫抑制中有著不同的作用。然而， Tim-3、LAG-3和BTLA等在ITP中的變化特點如何，則未見有相關的研究報道。

我們前期研究分析了ITP病人外周血T細胞中存在異常的TCR亞家族克隆增殖和TCR信號通路[1，2]。為此，本研究首先分析了其他T細胞抑制性受體包括Tim-3、LAG-3和BTLA在ITP中的表達特點。Tim-3是TIM家族成員[12]，主要參與Th細胞的分化及免疫調(diào)節(jié)作用，與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展以及誘導免疫耐受有關。TIM-3高表達于Th1和細胞毒性T細胞(Tc1)上，通過與其天然配體半乳糖凝集素-9(Galectin-9,Gal-9)結(jié)合介導表達Tim-3的抑制性T效應細胞的免疫抑制作用[13]。LAG-3(CD223)屬于免疫球蛋白超家族成員的一種跨膜蛋白，是近年來發(fā)現(xiàn)的另一種免疫抑制受體[11]，其配體為MHC-II分子。LAG-3分子主要表達于活化的T細胞和NK細胞表面，與MHC-II高親和力結(jié)合，抑制Th1細胞增殖和IFN-γ、IL-2和TNF-α等細胞因子的分泌。LAG-3也同樣抑制CD8+T細胞活性，抑制LAG-3分子可增加CD8+T細胞的增殖，促進IFN-γ的分泌和增強細胞毒性作用。而BTLA(CD272)是近年發(fā)現(xiàn)的又一種新的免疫抑制受體，是CD28家族新成員[14]。BTLA與其配體HVEM(皰疹病毒入侵介質(zhì))，結(jié)合啟動免疫抑制效應，負調(diào)節(jié)淋巴細胞的活化增殖，并可以抑制抗原刺激下的T細胞活化，通過抑制IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等細胞因子的分泌，下調(diào)免疫應答。這些分子都在不同方面負性調(diào)控T細胞功能。而與ITP中所發(fā)現(xiàn)的PD-1和PD-L1表達結(jié)果不一致，我們發(fā)現(xiàn)這三種基因的表達水平在ITP病人外周血單個核細胞中均有不同程度的升高，這提示了這些因子似乎發(fā)揮了正反饋的作用，在這些病人中，我們也發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1的表達水平明顯減低(結(jié)果另文報道)，因此，這可能提示不同的免疫抑制因子在ITP中的作用不盡相同，綜合分析多種免疫抑制性分子的變化特點，可能更好地綜合評價病人的免疫改變模式，但這些需要通過更多的樣本分析，同時更全面地從蛋白水平尤其是在可能的情況下，通過分析T細胞表面所表達的各種分子的情況，而獲得更全面的結(jié)果，才能更有效的采取相應的免疫治療和靶向治療手段。有報道，PD-1基因表達水平高低與腫瘤病人預后相關，主要是因為其影響了腫瘤病人的免疫狀態(tài)[15]，我們也嘗試分析比較難治ITP與常規(guī)治療有效病人樣本之間基因表達的差異性，盡管可能看到各基因表達水平有一定差異，但是無統(tǒng)計學意義，這可能是與樣本數(shù)較少有關，也可能是這種差異性的確與疾病難治無關，仍需擴大樣本進一步觀察和隨訪。

總之，本研究首先初步分析和報道了Tim-3、LAG-3和BTLA三種T細胞免疫抑制性受體基因在ITP中的表達紊亂情況，提供更為全面的ITP中免疫抑制受體的表達變化譜，也為進一步開展相應的免疫靶向治療和誘導免疫耐受提供新的資料，但本研究樣本量較少，仍有待進一步擴大研究而獲得更有代表性結(jié)果。

參考文獻：

[1]Zhang XL,Li YQ,Chen SH,etal.The feature of clonal expansion of TCR Vβ repertoire,thymic recent output function and TCR chain expression in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Int J Lab Hematol,2009,31(6):639-648.

[2]Zhang X,Chen S,Yang L,etal.The feature of TRGV and TRDV repertoire distribution and clonality in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Hematology,2009,14(4):237-244.

[3]冀學斌，侯明.誘導原發(fā)性免疫性血小板減少癥T細胞免疫耐受新途徑[J].中華血液學雜志，2014,35(9):862-865.

[4]Xu SQ,Wang CY,Zhu XJ,etal.Decreased indoleamine 2,3-dioxygenase expression in dendritic cells and role of indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing dendritic cells in immune thrombocytopenia[J].Ann Hematol,2012,91(10):1623-1631.

[5]Atesoglu EB,Tarkun P,Demirsoy ET,etal.Soluble programmed death 1 (PD-1) is decreased in patients with immune thrombocytopenia (ITP):potential involvement of PD-1 pathway in ITP immunopathogenesis[J].Clin Appl Thromb Hemost,2014 Dec 14.pii:1076029614562952.[Epub ahead of print]

[6]Shin DS,Ribas A.The evolution of checkpoint blockade as a cancer therapy:what′s here,what′s next?[J].Curr Opin Immunol,2015,33:23-35.

[7]Schubert D,Bode C,Kenefeck R,etal.Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations[J].Nat Med,2014,20(12):1410-1416.

[8]Arandi N,Mirshafiey A,Jeddi-Tehrani M,etal.Alteration in frequency and function of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2014,13(2):85-92.

[9]Li H,Ge J,Zhao H,etal.Association of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 gene polymorphisms with idiopathic thrombocytopenic purpura in a Chinese population[J].Platelets，2011,22(1):39-44.

[10]Shankar EM,Che KF,Messmer D,etal.Expression of a broad array of negative costimulatory molecules and Blimp-1 in T cells following priming by HIV-1 pulsed dendritic cells[J].Mol Med,2011,17(3-4):229-240.

[11]Nguyen LT，Ohashi PS.Clinical blockade of PD1 and LAG-3 potential mechanisms of action[J].Nat Rev Immunol,2015,15(1):45-56.

[12]卿吉琳,趙林,趙仁峰,等.TIM基因家族在疾病中作用的研究進展[J].中國免疫學雜志，2015,31(4):573-577.

[13]Wiener Z,Kohalmi B,Pocza P,etal.TIM-3 is expressed in melanoma cells and is upregulated in TGF- beta stimulated mast cells[J].J Invest Dermatol,2007,127(4):906-913.

[14]Sakoda Y,Park JJ,Zhao Y,etal.Dichotomous regulation of GVHD through bidirectional functions of the BTLA-HVEM pathway[J].Blood,2011,117(8):2506-2514.

[15]Rossille D,Gressier M,Damotte D,etal.High level of soluble programmed cell death ligand 1 in blood impacts overall survival in aggressive diffuse large B-Cell lymphoma:results from a French multicenter clinical trial[J].Leukemia,2014,28(12):2367-2375.

[收稿2015-09-10修回2015-09-28]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.021

作者簡介：鐘雋(1963年-)，女，主治醫(yī)生，主要從事血液病臨床診治研究工作。

通訊作者及指導教師:李揚秋(1962年-)，女，博士，研究員，博士生導師，主要從事血液腫瘤分子發(fā)病的機制和免疫治療的基礎研究。

中圖分類號R558.2R392.11

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1028-03

①本文受國家自然科學基金(No.81570143)資助。

②暨南大學醫(yī)學院血液病研究所，廣州510632。