趙　軍　左　麗　戴雪婷　裴　華　袁　靜　孔維瑩

(貴州醫(yī)科大學免疫學教研室,貴陽550004)

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登革病毒Ⅱ型引起原代HDMECs通透性變化機制的初步研究①

趙軍左麗戴雪婷裴華袁靜孔維瑩

(貴州醫(yī)科大學免疫學教研室,貴陽550004)

[摘要]目的：了解登革病毒Ⅱ型(Dengue virus Type 2,DENV-2)感染原代人真皮微血管內(nèi)皮細胞(Primary Human dermal micro-vascular endothelial cells,pHDMECs)引起細胞通透性改變的機制。方法：用103 TCID50的DENV-2感染pHDMECs；于4、8、12、24、48 h Real time-PCR、免疫熒光法及流式細胞術(shù)檢測DENV-2 NS1部分序列及蛋白；Transwell法檢測細胞通透性；Real time -PCR和雙抗體夾心ELISA法檢測IL-6和IL-8的變化；流式細胞術(shù)檢測24、48、72 h細胞凋亡。結(jié)果：DENV-2感染的pHDMECs 病毒NS1基因相對表達上調(diào)，但未檢測到病毒NS1蛋白；DENV-2感染的pHDMECs通透性在24、48 h顯著升高；pHDMECs被感染72 h后凋亡也無明顯變化； IL-6和IL-8 mRNA分別在8、24 h相對表達上調(diào)[IL-6：(2.49±0.5)倍,P<0.05；IL-8：(6.82±1.69)倍，P<0.05]；對照組和感染組分泌的IL-6于8 h分別為(869.6±50.7)、(1 248.8±86.9)pg/ml，P<0.05；IL-8于48 h分別為(967.6±156.6)、(1 331.0±86.3)pg/ml，P<0.05。結(jié)論：DENV-2能感染pHDMECs；pHDMECs被DENV-2感染后，細胞的通透性增加與凋亡無關(guān)，與促炎性細胞因子IL-6和IL-8明顯上調(diào)關(guān)系密切。

[關(guān)鍵詞]登革病毒；原代人真皮微血管內(nèi)皮細胞；IL-6；IL-8；通透性

登革病毒(Dengue virus,DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬，感染后引起癥狀較輕的登革熱(Dengue fever,DF)和嚴重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS)[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球每年約有3.9億人受到DENV感染，出現(xiàn)癥狀的約9 600萬，其中50萬人需要住院治療[2]。我國南方部分地區(qū)也不同程度地受到DENV的影響[3]，目前對DENV感染仍然沒有有效的疫苗和治療方法[1，2]。

DHF/DSS是導致患者死亡的主要原因，其主要癥狀包括微血管通透性增加、血漿滲漏、血小板減少、出血等癥狀?？贵w依賴的增強作用(Antibody dependent enhancement,ADE)及交叉反應性T細胞的激活被認為是DHF/DSS的重要致病機制[1,4]。二者共同作用引起“細胞因子風暴”，表現(xiàn)為DHF/DSS患者多種細胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、INF-γ、IL-1β、CXCL-10及MCP-1等高表達，導致血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cells,VECs)功能紊亂[1]。

DHF/DSS的病人中高表達的細胞因子主要來源于單核巨噬細胞、T淋巴細胞等多種免疫細胞[1]。研究表明，DENV感染VECs后分泌的多種細胞因子參與了機體的免疫應答過程。Nadine等[5]用DENV-4感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(primary human umbilical vein endothelial cells，pHUVECs)，發(fā)現(xiàn)促炎性因子IL-6、IL-8、CXCL-9、10、11及RANTES有不同程度的上調(diào)；Huang等[6]用DENV-2和DENV-3作用于HUVECs可直接上調(diào)IL-6和IL-8。臨床的研究表明IL-6和IL-8與DHF發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系[7]。IL-6是一種促炎性細胞因子，作用于VECs直接增加細胞的通透性，且與IL-6的濃度有相關(guān)性[8]。IL-8是與炎癥相關(guān)的趨化因子，DENV-2感染的HMEC-1分泌IL-8引起骨架重排使VECs的通透性增高[9]。至于DENV-2感染的pHDMECs通透性是否發(fā)生變化，以及與IL-6和IL-8之間的關(guān)系，目前還不清楚。

細胞凋亡是VECs損傷和通透性增加的重要因素，DENV-2感染是否引起VECs凋亡仍存在爭議，Long等[10]研究表明，DENV-2感染pHUVECs后通過外源性凋亡受體Fas/FasL途徑誘導細胞的凋亡產(chǎn)生；但是也有報道，DENV-2感染pHUVECs未見明顯細胞凋亡[11]。DENV-2感染是否引起pHDMECs凋亡，目前未見相關(guān)報道。

本次研究擬采用pHDMECs為內(nèi)皮細胞模型，錨定細胞凋亡的發(fā)生和細胞因子的分泌，初步探討DENV-2作用于pHDMECs通透性變化的機制，從而為DHF/DSS的發(fā)病機制提供新的科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株DENV-2國際標準株(NGC株) 本教研室增殖并保存于液氮。pHDMECs購于美國Sciencell公司；白紋伊蚊細胞(C6/36)購于中科院昆明細胞庫；BHK細胞為本教研室傳代保存。

1.1.2主要試劑及儀器ECM培養(yǎng)基及內(nèi)皮細胞生長因子添加物(ECGS)(美國Sciencell公司)；FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit with 7-AAD凋亡檢測試劑盒(Biolegend公司)；SsoFast EvaGreen Supermix及Real-time detection System(Bio-Rad公司)；Human IL-6 和IL-8 Platinum ELISA試劑盒(eBioscience公司)；引物序列(見表1，上海捷瑞生物工程有限公司)；熒光倒置顯微鏡(Nikon公司 TS100F)；流式細胞儀(BD公司)；多功能酶標儀(BioTek Synergy H4型)。

1.2實驗方法

1.2.1DENV-2的增殖、滴定與鑒定用C6/36細胞增殖病毒，TCID50法檢測并用Reed-Muench法計算病毒滴度，RT-PCR特異地擴增DENV-2 NS1部分序列(413 bp)及HindⅢ限制性內(nèi)切酶切割擴增產(chǎn)物以鑒定病毒。

1.2.2pHDMECs的培養(yǎng)與鑒定細胞長至90%融合度時，進行傳代培養(yǎng)，棄上清，PBS液洗滌，0.25%胰蛋白(含EDTA)消化后，加全培養(yǎng)基(10%FBS-ECM含ECGS)終止消化，離心，棄上清加全培養(yǎng)基重懸細胞，分瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)；細胞傳至3～4代，收集細胞樣本，分別用免疫組化法和流式細胞術(shù)檢測pHDMECs的Ⅷ因子相關(guān)蛋白和CD31。

1.2.3Real-time PCR檢測DENV-2 NS1部分序列的表達以103TCID50/ml的DENV-2感染pHDMECs(融合度約90%)，于4、8、12、24及48 h收集細胞提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測內(nèi)參基因β-Actin和目的基因NS1部分序列擴增循環(huán)數(shù)(Ct)，用2-△△Ct法計算NS1部分序列在各時間點的相對表達。

1.2.4免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測DENV-2對pHDMECs的感染選取生長融合度為90%的pHDMECs，制成細胞懸液，2×105個細胞/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2孵育24 h后，接種103TCID50/孔的DENV-2液孵育2 h，棄液洗滌，加2% FBS-ECM培養(yǎng)基(含ECGS)維持培養(yǎng)，分別于24、48和72 h收集細胞樣本。免疫熒光法：細胞樣本經(jīng)過4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X-100破膜，2%FBS封閉后，加抗NS1單克隆抗體，4℃孵育過夜；次日，加二抗(FITC-兔抗小鼠)孵育1～2 h，DAPI工作液染核后，熒光倒置顯微鏡拍照記錄結(jié)果。流式細胞術(shù)：細胞樣本依次孵育抗NS1單克隆抗體和FITC標記二抗(兔抗小鼠)，流式細胞儀檢測熒光強度的變化。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測pHDMECs凋亡DENV-2感染pHDMECs，在24、48和72 h收集細胞制成細胞懸液，分別用 FITC-Annexin Ⅴ和7-AAD染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6DENV-2感染的pHDMECs通透性檢測將200 μl/孔細胞液含有(4×105個細胞)接種于纖粘蛋白包被的Transwell小室，下室加600 μl全培養(yǎng)基，放37℃、5%CO2孵育；24 h后待細胞鋪滿單層，接100 μl/孔DENV-2(103TCID50/ml)，空白組和陽性組分別加無血清ECM培養(yǎng)基和LPS(0.2 mg/ml)，37℃、5%CO2孵育2 h，棄液加2%FBS-ECM(含ECGS)維持培養(yǎng)；于4、8、12、24和48 h 加50 μl/孔 FITC-dextran(0.2 mg/ml)，37℃孵育30min，收集下室培養(yǎng)液，用BioTek Synergy H4型多功能酶標分析儀檢測熒光值(488 nm，525 nm)。

1.2.7Real-time PCR檢測相關(guān)基因的表達于4、8、12、24及48 h收集DENV-2感染的pHDMECs細胞樣本，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測內(nèi)參基因β-Actin和目的基因IL-6，IL-8的Ct值，用2-△△Ct法計算上述目的基因在各時間點的相對表達。

1.2.8雙抗夾心ELISA法檢測pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8的濃度DENV-2感染4、8、12、24及48 h pHDMECs的培養(yǎng)上清依次加入待使用的孔中，同時加2% FBS-ECM(空白對照)和倍比稀釋的標準品，均為復孔，每孔50 μl；然后加50 μl/孔 Biotin-conjugate液；室溫孵育2 h；棄去孔中液體，用洗滌緩沖液洗滌，甩干，加入100 μl/孔 Streptavidin-HPR室溫孵育1 h；用洗滌緩液洗滌；每孔加100 μl TMB顯色劑，室溫避光孵育10 min；各孔中迅速的加入100 μl 終止液，BioTek Synergy H4型多功能酶標分析儀檢測吸光度(450 nm)。

1.3統(tǒng)計學方法使用SPSS22.0軟件對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，DENV-2感染組和對照組之間的差異用方差分析檢驗。

2結(jié)果

2.1pHDEMCs的培養(yǎng)與鑒定用10% FBS-ECM 全培養(yǎng)基(含ECGS)培養(yǎng)的pHDMECs在3 d左右均勻鋪滿單層，形態(tài)、大小一致，呈鵝卵石或者梭形(圖1)；免疫組化法檢測Ⅷ因子相關(guān)蛋白，pHDMECs被染成棕褐色，而陰性對照BHK細胞染色前后無顏色變化(圖2)；另外流式細胞術(shù)檢測CD31，同型對照和實驗組分別呈兩個獨立單峰，后者陽性率達99.7%(圖3)。

2.2DENV-2的滴定與鑒定Reed-Muench法計算病毒的滴度為7×106TCID50/ml；DENV-2 NS1部分序列大小為413 bp，NEBcutter V2.0軟件對NS1部分序列進行分析，此序列存在一個HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點，酶切產(chǎn)物分別為228 bp和185 bp；RT-PCR擴增后，病毒感染組于413 bp處出現(xiàn)清晰明亮的條帶，擴增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切可見明顯的228 bp與185 bp條帶(圖4)，證明此病毒為DENV-2。

圖1　pHDMECs培養(yǎng)至第3天(×100)Fig.1　pHDMECs culture at 3rd day(×100)

圖2　免疫組化法鑒定pHDMECs(×100) Fig.2　pHDMECs identified by immunohistochemistry(×100)Note: A.BHK cells as negative control;B.pHDMECs.

圖3　pHDMECs CD31分子的表達Fig.3　Expression of CD31 on pHDMECs

2.3DENV-2感染的pHDMECs NS1部分序列相對表達DENV-2感染的pHDMECs 4、8、12、24及48 h NS1部分序列基因熔解曲線峰位置相同，單形單一，說明未出現(xiàn)非特異性擴增(圖5)；以4 h NS1部分序列基因的相對表達(2-△△Ct值)作為基準，其他時間點NS1部分序列基因相對表達顯著升高，48 h達到最大值(圖6)，說明DENV-2能夠感染pHDME Cs， NS1部分序列基因的拷貝數(shù)隨著時間逐漸增加。

2.4免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測DENV-2對pHDMECs的感染DENV-2感染BHK細胞和pHDMECs 72 h，免疫熒光法檢測NS1部分序列蛋白的結(jié)果如圖7所示；圖8為流式細胞術(shù)檢測結(jié)果，對照組與感染組平均熒光強度分別為(311±11)和(429±14)(P>0.05)，而DENV-2感染的BHK細胞分別為(195±5.5)和(830±33.7)(P<0.05)，兩組之間具有明顯的差別。結(jié)果表明pHDMECs被DENV-2感染72 h后無NS1部分序列蛋白的表達。

圖4　DENV-2的NS1部分序列擴增產(chǎn)物及HindⅢ酶切片段Fig.4　Identificating partial nucleotide sequences of DENV-2 and PCR production cutting by HindⅢNote: 1.Mark Ⅰ;2.Control;3.PCR production of DENV-2;4.PCR production cutting by HindⅢ.

圖5　DENV-2 NS1部分序列基因的熔解曲線Fig.5　Melt curve of DENV-2 NS1

2.5DENV-2感染的pHDMECs通透性檢測通過檢測FITC-dextran熒光值來反應通透性的變化，如圖9所示，24 h Control及DENV-2組的熒光值分別為(62.6±17.6)和(95.8±11.8)，P<0.05；48 h分別為(36.2±8.8)和(68.5±9.2)，P<0.05，提示在此時間點pHDMECs的通透性增加。

2.6流式細胞儀檢測DENV-2對pHDMECs凋亡pHDMECs被DENV-2感染24、48和72 h均未發(fā)生明顯凋亡。如圖10所示，pHDMECs被DENV-2感染72 h早期凋亡和壞死的比例分別為32.6%和3.13%，對照組為32.4%和2.36%，提示DENV-2感染pHDMECs不能引起細胞凋亡。

2.7Real time-PCR檢測促炎性細胞因子β-Actin、IL-6和IL-8三種基因的熔解曲線峰為均一的單峰(如圖11)；IL-6和IL-8在各時間點的相對表達(2-△△Ct)如圖12所示，IL-6 mRNA在8 h上調(diào)(2.49±0.5)倍，P<0.05，IL-8 mRNA在24 h上調(diào)(6.82±1.69)倍，P<0.05。

圖6　DENV-2感染的pHDMECs 4、8、12、24和48 h NS1基因的相對表達Fig.6　Related expression of NS1 gene in pHDMECs in 4,8,12,24 and 48 h by DENV-2 infectionNote: Compare with 4 h，*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖7　免疫熒光法檢測DENV-2對pHDMECs的感染(×100)Fig.7　Immunofluorescence showed infection of pHDM-ECs and BHK cells(×100) Note: A.BHK cells was infected by DENV-2 as positive control；B.DENV-2 infected pHDMECs.

圖8　FCM檢測DENV-2感染的pHDMECs中NS1部分序列蛋白Fig.8　Determination of protein NS1 of DENV-2 infected pHDMECs by FCMNote: A,B.Isotype control of BHK cells and pHDMECs；C,D.BHK cells and pHDMECs was infected by DENV-2.

圖9　Transwell小室中pHDMECs被DENV-2感染后下室熒光值的動態(tài)變化Fig.9　Dynamic fluorescence values in out-chamber of Transwell where was cultured DENV-2 infected pHDMECs

圖10　DENV感染的pHDMECs 72 h的凋亡Fig.10　Apoptosis of pHDMECs with DENV-2 incubation in 72 hNote: Ratio of cell late apoptosis and necrosis was scattered in Q2；cell early apoptosis in Q3;A.Blank control；B.pHDMECs was infected by DENV-2.

圖11　β-Actin，IL-6，IL-8 mRNA熔解曲線Fig.11　Melt curves of β-Actin，IL-6 and IL-8 mRNA Note: A.β-Actin;B.IL-6;C.IL-8.

圖12　pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8mRNA的相對表達變化Fig.12　Relative expression of IL-6 and IL-8 mRNA of DENV-2 infected pHDMECs in various timesNote: Compare with control,***.P<0.001.

圖13　pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8的分泌Fig.13　Assay of IL-6 and IL-8 secretion by DENV-2 infected pHDMECsNote: Compare with control,***.P<0.001.

表1相關(guān)基因的擴增引物

Tab.1Enhancement primer of related Genes

GenePrimer(5'→3')Length(bp)Tmβ-ActinF:GCATGGGTCAGAAGGATTCCTR:TCGTCCCAGTTGGTGACGAT11260NS1F:AGAGCGTGAAAAGGTGGATGR:CTGTCTGCGTAGTTGATGCC14760IL-6F:GCATAAAGACATACTCCAAACCR:ACTTCTCCACAACCCTCTG16855IL-8F:TTCGGTCCAGTTGCCTTCTR:GGTGAGTGGCTGTCTGTGTG12060

2.8雙抗體夾心ELISA法檢測pHDMECs被DENV-2感染后細胞因子的分泌DENV-2感染pHDMECs在各時間點IL-6和IL-8蛋白水平如圖13所示，在8 h IL-6蛋白水平明顯高于對照組；IL-8在4～24 h DENV-2感染組和對照組之間無明顯差異，而在48 h明顯增高。

3討論

DENV主要通過白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播，可引起致命的DHF/DSS，表現(xiàn)為微血管滲漏、伴有血小板下降、出血甚至休克等癥狀，其致病機制至今尚不完全清楚[1,7]。

DENV感染過程中引起的VECs功能紊亂和通透性增加是DHF/DSS重要的發(fā)病機制[7]，所以各種VECs成為研究DENV感染致病機制的細胞模型，但各種內(nèi)皮細胞株并不是完美的模型。ECV 304細胞已證實為膀胱癌細胞系而不是VECs[12]。研究表明，DENV感染后重癥患者微脈管系統(tǒng)通透性顯著增強，常見胸腔積液、腹水等血漿滲漏癥狀和皮下、胃腸道等明顯出血傾向，而不是大血管內(nèi)皮細胞(如HUVECs)[13]；目前也有用微血管細胞株HMEC-1研究DENV致病機制的報道，但HMEC-1是經(jīng)過攜帶猴病毒40A基因的pSVT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的穩(wěn)定細胞株，并非原代微血管細胞[14]，因此，以上VECs模型并不能真實地反映機體各組織器官的VECs被DENV感染的情況。

DENV是否能感染VECs及DENV是否在VECs內(nèi)有效增殖，是否能夠引起VECs通透性的改變？研究表明，DENV可通過β3整合素或含有硫酸肝素的蛋白多糖受體感染HUVECs[15]。本課題以DENV-2作用pHDMECs，病毒NS1部分序列基因相對表達顯著增加，具有時間相關(guān)性，但未能檢測到DENV-2 NS1蛋白，由此可知pHDMECs能夠被DENV-2感染?？赡苁怯捎贒ENV-2感染的pHDMECs分泌IFN-β而抑制了DENV-2相關(guān)蛋白合成[8]，此結(jié)果與pHUVECs感染情況一致[11]。同時被DENV-2感染的pHDMECs通透性顯著增高，提示感染后的pHDMECs形態(tài)和功能可能發(fā)生了變化，這將對DENV感染引起的出血產(chǎn)生重要影響，同時也驗證了DHF/DSS患者出現(xiàn)皮下出血癥狀的原因[7]。

DENV-2引起pHDMECs通透性增加可能有以下兩種原因：DENV-2直接對pHDMECs產(chǎn)生的損傷作用。細胞凋亡是VECs損傷和通透性增加的重要因素，然而DENV感染VECs是否引起細胞凋亡仍是個爭論的問題。臨床研究表明，DENV-2僅僅引起VECs短暫的通透性增加，并無血管內(nèi)皮的損傷[15]；Qi等[11，16]在體外實驗證實DENV-2感染的pHUVECs沒有明顯細胞凋亡 。但是Long等[10]研究表明，DENV-2感染pHUVECs后通過外源性調(diào)亡受體Fas/FasL途徑誘導細胞的凋亡產(chǎn)生。本次研究表明，以DENV-2感染pHDMECs未見明顯細胞凋亡，其原因可能為上調(diào)的IFN-α誘導基因IFI6抑制了細胞凋亡[16]。因此，DENV-2引起pHDMECs通透性增加與細胞凋亡無關(guān)。VECs的損傷在DHF/DSS患者中并不具有普遍性，由此推斷細胞凋亡可能不是DENV致病機制的重要因素。但有報道稱，DENV-2 NS1部分序列蛋白通過TLR4途徑直接引起HUVECs通透性增加，但本次研究中未檢測到DENV-2 NS1部分序列蛋白，因此可排除其對pHDMECs通透性增加的直接作用[17]。

DENV-2感染的pHDMECs發(fā)生功能紊亂，分泌相關(guān)細胞因子所致。研究表明，VECs被DENV感染后導致部分細胞因子上調(diào)，這些因子可能也是DHF/DSS患者上調(diào)的細胞因子來源之一[4，5]。VECs可能作為非免疫細胞參與了DENV感染的免疫應答過程。本次研究中，DENV-2感染的pHDMECs IL-6，IL-8分泌顯著增加，且與pHDMECs通透性增加的時間點有相關(guān)性。IL-6作用于HUVECs可增加細胞通透性，并與IL-6的濃度呈正相關(guān)[8]。DENV-2引起pHDMECs通透性的變化可能是IL-6調(diào)節(jié)細胞緊密連接及細胞骨架相關(guān)蛋白所致。Tina等[18]研究表明，IL-6通過PKC通路使ZO-1和細胞骨架蛋白actin發(fā)生重排增加VECs的通透性。此外，IL-6通過JUK、MEK及PI3K信號通路上調(diào)Claudin-2來調(diào)節(jié)腸上皮細胞的緊密連接[19，20]。IL-8可能直接作用于pHDMECs使其通透性發(fā)生改變。研究表明，DENV-2感染HMEC-1細胞釋放的IL-8使細胞骨架發(fā)生重排使VECs的通透性增加[9]。IL-8也是CXC型趨化因子，可激活和趨化中性粒細胞、單核細胞及T淋巴細胞[21]，從而間接地影響pHDMECs的結(jié)構(gòu)與功能。如DENV感染的VECs釋放IL-8趨化并誘導中性粒細胞脫顆粒并釋放彈性蛋白酶(Elastase)，后者可損傷VECs和激活補體系統(tǒng)而使VECs的通透性發(fā)生改變[22]。據(jù)此推測，IL-6、IL-8在DENV-2感染引起pHDMECs通透性增加過程發(fā)揮了重要的作用。

研究與DENV感染致病機制密切相關(guān)的細胞因子并作為治療靶點對防治重癥DENV感染疾病具有重要意義。pHDMECs被DENV-2感染后，是否分泌其他引起細胞通透性增加的細胞因子仍需探索。盡管如此，也有研究表明促炎性細胞因子IL-6和IL-8能激活或趨化多種免疫細胞至感染部位，在急性感染期保護機體免受病原體的侵害[23]。由此推測，在DENV感染過程中多數(shù)細胞因子既保護了機體也促進疾病發(fā)展，可能因為產(chǎn)生的階段以及量上的差異而表現(xiàn)出相反的作用。這也為研究DENV引起VECs通透性增加的機制提供了新視角。

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[收稿2016-04-06]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.003

作者簡介：趙軍(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事抗病毒感染的分子免疫學研究，E-mail:zddjet@foxmail.com。 通訊作者及指導教師：左麗(1955年-)，女，教授，博士生導師，主要從事抗病毒感染的分子免疫學方面研究，E-mail:zuoligymc@163.com。

中圖分類號R392.9

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0945-07

Primary mechanism of changing permeability in DENV-2 infected primary human dermal micro-vascular endothelial cells

ZHAO Jun,ZUO Li,DAI Xue-Ting,PEI Hua,YUAN Jing,KONG Wei-Ying.

Department of Immunology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China

[Abstract]Objective:To reveal the primary mechanism of changing permeability in DENV-2 infected pHDMECs.Methods: pHDMECs was incubated by DENV-2 on the concentration of 103 TCID50,and the penetrability of the cell was detected by Transwell at 4,8,12,24,48 h,respectively.Then,the partial sequence of DENV-2 NS1 was analyzed by Real time-PCR,and NS1 protein was detected by immunofluorescence and flow cytometer (FCM).The apoptosis rate of pHDMECs was assayed by FCM.Finally,IL-6 and IL-8 secreted by pHDMECs were analyzed by Real time-PCR and double antibody sandwich ELISA.Results: The relative expression of NS1 gene was elevated but NS1 protein was not detected;the permeability of DENV-2 infected pHDMECs had dramatically increased both at 24,48 h,but the apoptosis rate has little changed even been influenced by DENV-2 at 72 h.However,the relative expression of IL-6/IL-8 mRNA was boosted at 8,24 h[(2.49±0.50) and (6.82±1.69) fold,respectively,P<0.05].In protein level,compared with control(869.6±50.70)pg/ml,IL-6 secreted by DENV-2 infected pHDMECs could reach by(1 248.8±86.9)pg/ml(P<0.05),and IL-8 was(1 331.0±86.3)pg/ml(P<0.05) while the control was (967.6±156.6)pg/ml.Conclusion: Indeed,pHDMECs can be infected by DENV-2;the increasing permeability of DENV-2 infected pHDMECs may not be caused by the pHDMECs′ apoptosis but the enhancing of pro-inflammatory cytokine IL-6 /IL-8.

[Key words]Dengue virus；Primary human dermal micro-vascular endothelial cells；IL-6；IL-8；Permeability

①本文為國家自然科學基金(31260224；81560263)和貴州省教育廳“125”重大科技專項(黔教合重大專項字[2012]008號)。