汪元符（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西南昌330038）

GPC-UPLC-MS/MS測(cè)定濕潤(rùn)燒傷膏中罌粟殼化學(xué)成分

汪元符（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西南昌330038）

目的：針對(duì)中藥制劑濕潤(rùn)燒傷膏，建立其中罌粟殼所含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5種化學(xué)成分的凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法。方法：色譜柱為Phenomenex Kinetex HILIC 100A（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱溫為40℃；流動(dòng)相為10 mmol/L甲酸銨（以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）及乙腈，梯度洗脫；流速為0.2 m L/m in，以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號(hào)。結(jié)果：各成分檢出限濃度為0.1～0.5 ng/m L；定量限濃度為0.5～1.0 ng/m L；線性范圍為各成分定量限～100 ng/m L；在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；平均加樣回收率86.5%～99.6%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好；能用于濕潤(rùn)燒傷膏中罌粟殼化學(xué)成分的檢測(cè)。

凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜；濕潤(rùn)燒傷膏；罌粟殼；化學(xué)成分

濕潤(rùn)燒傷膏是療效顯著，家庭常備的中藥制劑。根據(jù)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］，是由黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼制成。標(biāo)準(zhǔn)［1］收載了黃連、黃柏中鹽酸小檗堿及黃芩中黃芩素的含量測(cè)定。在2015年版《中國藥典》［2］中藥飲片罌粟殼項(xiàng)下，收載了嗎啡的含量測(cè)定。由文獻(xiàn)［3-4］，罌粟殼有5種生物堿化學(xué)成分（罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因）可建立含量測(cè)定，其中罌粟堿、嗎啡、可待因是最重要的3種。作為一種方法補(bǔ)充，本實(shí)驗(yàn)室建立了凝膠滲透色譜-超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（GPC-UPLC-MS/MS），用于檢測(cè)濕潤(rùn)燒傷膏中組藥罌粟殼所含的罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5種化學(xué)成分。

1　儀器、試劑與材料

磐合Freestyle SPE/EVA凝膠滲透色譜儀，AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜，ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706型醫(yī)用低速離心機(jī)，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，亞榮RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，ANPEL DC-24氮吹儀，M illipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck），乙酸乙酯（色譜純，Merck），環(huán)己烷（色譜純，Merck），甲酸（色譜純，天津科密歐），甲酸銨（色譜純，武漢偉琪博星）。

對(duì)照品：鹽酸罌粟堿（批號(hào)：171214-201205）、嗎啡（批號(hào)：1712101-201123）、那可?。ㄅ?hào)：171224-200403）、磷酸可待因（批號(hào)：171203-201306）、蒂巴因（批號(hào)：171216-201304），均為中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：購自流通或醫(yī)療機(jī)構(gòu)。規(guī)格：40 g，共6個(gè)批次：20140501，20140610，20140802，20141020，20150122，20150310，對(duì)應(yīng)編號(hào)為①～⑥。

2　方法與結(jié)果

2.1　高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Kinetex HILIC 100A （100 mm×2.1 mm，1.7μm）。柱溫：40℃。流速：0.2m L/min。進(jìn)樣量：5μL。流動(dòng)相：A為10mmol/L甲酸銨以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

2.2　質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式（ESI+）。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)。掃描范圍：50～600 Da。氣簾氣壓力：25 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5 500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：55 Pa。輔助氣壓力：50 Pa。界面加熱狀態(tài)：開。離子對(duì)選擇見表2。

表1　梯度洗脫程序

表2　質(zhì)譜分析

2.3　對(duì)照品溶液的配制

取鹽酸罌粟堿、嗎啡、那可丁、磷酸可待因、蒂巴因?qū)φ掌犯骷s10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 m L中各含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因1 mg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 m L，以甲醇制成各含1 000 ng/m L 和100 ng/m L的溶液，作為對(duì)照品使用液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：以25 m L量瓶制備，分別精密量取濃度為100 ng/m L和1 000 ng/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液適量，以甲醇定容至25m L，制成各含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2.4　供試品溶液的配制

將6批樣品分別混勻，各取10 g，精密稱定，置具塞燒瓶中，加入甲醇約100 m L，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 m in，放冷至室溫，以10 000 r/m in離心15 m in后，取上清液置雞心瓶中，40℃旋蒸至近干，以10 m L乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1）復(fù)溶，以0.2μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液上凝膠滲透色譜凈化處理。

凝膠滲透色譜凈化參數(shù)：凈化柱（400 mm× 25mm），采用BIO-Beads S-X3填料，200～400目，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1），流速5m L/min，進(jìn)樣量5 m L，開始收集時(shí)間15 m in，結(jié)束收集時(shí)間40 m in，定量濃縮至1.0 m L。

取濃縮好的凈化樣，氮?dú)獯蹈桑?.0 m L甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液測(cè)定。

2.5　對(duì)照品濃度為5 ng/m L時(shí)各離子對(duì)提取質(zhì)譜圖

見圖1至圖10。

1　罌粟堿定量離子對(duì)（340.7/202.1）提取質(zhì)譜圖

2　罌粟堿定性離子對(duì)（340.7/171.0）提取質(zhì)譜圖

3　嗎啡定量離子對(duì)（286.3/165.0）提取質(zhì)譜圖

4　嗎啡定性離子對(duì)（286.3/181.2）提取質(zhì)譜圖

5　那可丁定量離子對(duì)（414.8/220.0）提取質(zhì)譜圖

6　那可丁定性離子對(duì)（414.8/353.3）提取質(zhì)譜圖

7　可待因定量離子對(duì)（299.8/215.1）提取質(zhì)譜圖

8　可待因定性離子對(duì)（299.8/165.0）提取質(zhì)譜圖

9　蒂巴因定量離子對(duì)（312.5/58.0）提取質(zhì)譜圖

10　蒂巴因定性離子對(duì)（312.5/249.0）提取質(zhì)譜圖

2.6　定性確認(rèn)

采用保留時(shí)間與對(duì)照品相一致，且定性與定量離子對(duì)相對(duì)離子豐度比應(yīng)滿足表3要求，判為檢出。

表3　定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差（%）

各對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果見表4。

2.7　線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測(cè)。以檢測(cè)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（ng/m L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對(duì)和定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時(shí)的濃度（ng/m L）為檢出限。以定性離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時(shí)的濃度（ng/m L）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，為線性范圍。結(jié)果見表5。

表4　對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果

2.8　精密度試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見表6。

表5　線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表6　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9　穩(wěn)定性試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見表7。

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表7　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10　回收率試驗(yàn)

自制罌粟殼陰性空白樣品。以黃連、黃柏、黃芩、地龍等比混合，打成細(xì)粉，再與麻油適當(dāng)混勻，按“2.4”項(xiàng)制備空白供試品溶液，再按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下的條件檢測(cè)，確證罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5種化學(xué)成分均為陰性。以此為陰性空白樣，平行取9份，分別為10 g，各精密加入標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中濃度為5，50，100 ng/m L標(biāo)準(zhǔn)液，加入量為2 m L，然后按“2.4”項(xiàng)下其余步驟制備樣液，則最終得加標(biāo)樣液濃度理論值應(yīng)為5，50，100 ng/m L，以此計(jì)算回收率，結(jié)果見表8。

表8　加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果各化學(xué)組分高、中、低三個(gè)濃度的回收率均在86.5%～99.6%之間。

2.11　樣品測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)了6批次樣品，結(jié)果見表9。

3　討論

3.1　凝膠滲透色譜收集時(shí)間的選擇

因樣品為油性基質(zhì)，對(duì)含量測(cè)定干擾較大，故采用GPC凈化。經(jīng)采集不同收集時(shí)間段的樣液進(jìn)行檢測(cè)，在15 m in之前及40 min之后未檢出目標(biāo)化合物，因此在15 m in至40 m in之間為有效收集時(shí)間。

表9　 6批樣品檢測(cè)結(jié)果（μg/g）

3.2　液相色譜條件的選擇

罌粟殼所含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5種化學(xué)成分極性較強(qiáng)，試用C18柱，樣品在0.5 m in內(nèi)出峰，幾無保留，所以采用親水柱。

采用甲酸銨鹽緩沖液-乙腈系統(tǒng)，離子化效率高，離子強(qiáng)度大，檢測(cè)靈敏度高。為提高檢測(cè)限，改善峰形，采用梯度洗脫的方式。比較了不同pH值的流動(dòng)相，結(jié)果在pH值為3.0時(shí)各成分分離較好。

3.3　質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選用靈敏度最高的一組離子對(duì)作為定量離子對(duì)，再選擇靈敏度次高的一組離子對(duì)作為定性離子對(duì)。

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)）第40冊(cè).濕潤(rùn)燒傷膏［S］.WS3-043（Z-005）-2002（Z），2002.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：369-370.

［3］李雕，李進(jìn)瞳，曾燕，等.不同等級(jí)罌粟殼有效成分含量的研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（17）：32-35.

［4］徐麗紅，王建清，陶秋，等.高效液相色譜同時(shí)測(cè)定3類食品中的5種罌粟殼生物堿［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2011，30（12）：65-69.

［5］張林田，黃少玉，陸奕娜，等.固相萃取/HPLC-MS/MS檢測(cè)食品中嗎啡等五種罌粟殼生物堿殘留［J］.分析試驗(yàn)室，2014，33 （6）：108-111.

［6］祝偉霞，楊冀州，劉亞風(fēng)，等.四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于食品中罌粟殼特征成分的確證［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015，34（5）：7-13.

Determ ination of Chem ical Com ponents of Papaveris Pericarpium in MEBO by GPC-UPLC-MS/MS

Wang Yuanfu（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To develop a GPC-UPLC-MS/MS method for determ ination of five chem ical components （papaverine，morphine，narcotine，codeine and thebaine）of papaveris pericarpium in MEBO.M ethods：Phenomenex Kinetex HILIC 100A column（100 mm×2.1 mm，1.7μm）was adopted.The column temperature was 40℃.The mobile phase was 10 mmol/L ammonium formate（pH 3.0）-acetonitrile，which was used for gradient elution at a flow rate of 0.2 m L/min.The signals were collected by using the optimized parameters.Results：The detection lim it of this method was 0.1～0.5 ng/m L，while the lim it of quantitation was 0.5～1.0 ng/m L，and the linear range was the lim it of quantitation～100 ng/m L.The correlation coefficients w ithin the linear range were more than 0.99.The average recoveries of test samples were 86.5%～99.6%.Conclusion：This method shows high accuracy，sensitivity and specificity，which may be used for the determination of five chemical components of papaveris pericarpium in MEBO.

GPC-UPLC-MS/MS；MEBO；Papaveris Pericarpium；Chemical Component

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.003

汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測(cè)及食品安全。E-mail：wanngel@126.com

2016-03-10）