周貽兵，吳坤，李磊，林野，劉利亞，*（.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550004；.貴州師范學(xué)院，貴州貴陽55008）

UPLC-MS/MS法測定魚肉中硝基呋喃代謝物殘留量

周貽兵1，吳坤2，李磊1，林野1，劉利亞1，*
（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550004；2.貴州師范學(xué)院，貴州貴陽550018）

采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中AHD、AMOZ、AOZ、SEM殘留。樣品經(jīng)鹽酸水解，與2-NB在37℃水浴中衍生16 h后，離心，加入0.5 mol/L磷酸氫二鉀2 mL，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.1～7.5之間，乙酸乙酯萃取，氮吹，流動相定容。采用電噴霧MRM正離子模式掃描，內(nèi)標(biāo)法定量。4種代謝物在2.5μg/kg～50μg/kg的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 3，最低檢出限為0.2 μg/kg。在樣品中加入（1、10、20 μg/kg）3個濃度水平，平均回收率83.0%～101%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDn=6）在4.2%～11.3%之間。使用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，校正了衍生不完全、光照分解、溶液pH對提取效率的影響，提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，適用于魚肉中4種硝基呋喃代謝物的確證。

硝基呋喃代謝物；魚；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。因低濃度抑菌，高濃度殺菌的作用，被廣泛用于飼料添加劑來預(yù)防和治療沙門菌或大腸桿菌等引起的疾病。后來研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物及其代謝物在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類。呋喃唑酮及其代謝物具有致突變、致癌作用［1］。硝基呋喃類化合物是直接致變劑，無需外源性激活系統(tǒng)就可引起細胞突變。硝基呋喃類抗生素具有對光敏感、代謝快的特點，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時，通常不太可能檢出原藥的殘留，如呋喃唑酮在停藥后12 h內(nèi)從組織中消失，而代謝物以組織蛋白結(jié)合態(tài)的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時，檢測動物組織中硝基呋喃原藥不足以反映其真實的殘留水平，因此，檢測其代謝物濃度仍是可能的。呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因在動物體內(nèi)的代謝物分別為3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD），當(dāng)吃了含有硝基呋喃代謝物殘留的食品，代謝物在胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來被人體吸收而對人類健康造成危害。2002年我國農(nóng)業(yè)部第193號公告也將硝基呋喃抗菌劑列入《食品動物禁用的獸藥和其他化合物清單》，但硝基呋喃藥物療效好，價格低廉，農(nóng)戶片面追求經(jīng)濟效應(yīng)，目前非法使用屢有發(fā)生，如2006年國內(nèi)影響較大的多寶魚、桂花魚中檢出硝基呋喃事件［1］。由于這些標(biāo)志物檢測技術(shù)難度較大，因此分析硝基呋喃代謝物成為當(dāng)前眾多學(xué)者研究的焦點。

目前，國內(nèi)外報道用于檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有試劑條法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）。ELISA法由于采用了特異性抗體，具有靈敏度高、經(jīng)濟、操作簡便、檢測時間短等優(yōu)點，但仍然不能實現(xiàn)在線檢測，假陽性率較高。所以ELISA法一般用于藥物殘留的定性分析，只能對藥物殘留進行初步篩查，陽性樣品需要進一步確證。HPLC法廣泛用于多組分混合物的分離和分析，特別是有機化合物的定量分析。動物組織基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾較多，定性仍較困難，易出現(xiàn)假陽性。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，大大提高了分析的靈敏度、選擇性、特異性和準(zhǔn)確性。HPLC-MS/ MS法采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）模式，結(jié)合液相保留時間及MRM特征離子對進行定性和定量，可以減少由于保留時間相同而待測離子不同所帶來的干擾，同時提高了檢測靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析［2-17］。所以本文在國標(biāo)GB/T 21311-2007和農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006方法基礎(chǔ)上，減少了洗滌去除脂肪的步驟，同時考察了pH和光照對測定的影響。在酸性條件下使硝基呋喃代謝物與蛋白質(zhì)水解成游離態(tài)，2-硝基苯甲醛（2-NB）衍生，乙酸乙酯提取，UPLC-MS/ MS內(nèi)標(biāo)法測定魚肉中硝基呋喃代謝物殘留量。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Ultimate 3000超高壓液相色譜儀，TSQ Quantum ultra三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）：賽默飛世爾科技有限公司；高速離心機：SiGma公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，超純水機：艾科浦；恒溫水浴鍋：上海百典儀器設(shè)備儀器有限公司；梅特勒pH計：上海艾測電子科技有限公司。

硝基呋喃代謝物以及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品［AOZ（AOZ-D4），AMOZ（AMOZ-D5）、AHD.HCl（AHD-13C3）、SEM.HCl （SCA-13C15N2），純度≥99.0%］：Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸乙酯為色譜純：購置于美國Fisher公司；鄰硝基苯甲醛（純度大于99%）：購置于北京裕策達科貿(mào)有限公司；磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：均購置于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；優(yōu)級純鹽酸：廣州綠百草生物科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)標(biāo)10mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，各組分濃度均為1.0 mg/mL。吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制成0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液。

衍生化試劑（0.1 mol/L）：稱取0.15 g鄰硝基苯甲醛溶于10 mL乙腈中，臨用現(xiàn)配。

1.2樣品的處理

鮮活魚經(jīng)剖殺去除掉頭、骨、內(nèi)臟，將肉切成塊狀，用電動絞肉機打成漿狀，于-20℃避光保存待測。

將魚樣解凍，準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液、0.2 mol/L的鹽酸溶液10 mL和0.3 mL衍生劑，旋渦混勻，置于37℃水浴避光衍生16h，衍生完成后，10000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移水解液于50 mL離心管中，加入2mL 0.5mol/L的K2HPO4溶液，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH在7.1～7.5之間，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋，靜置分層，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入25 mL離心管中，再加入10 mL乙酸乙酯萃取，合并萃取溶液，氮氣吹干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水（體積比為10∶90）定容，過0.22 μm濾膜，供測定。

1.3色譜條件

色譜柱：HypersilGold-C18，150mm×2.1 mm×1.9 μm （Thermo）；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution conditions

1.4質(zhì)譜條件

離子源：ESI（+）；噴霧電壓：3 000 V；毛細管溫度：350℃；蒸發(fā)溫度：0℃；鞘氣壓力：276 kPa；輔助氣壓力：4.5 L/min；碰撞氣（Ar）壓力：0.2 Pa。SRM優(yōu)化參數(shù)見表2。

表2　4中硝基呋喃代謝物和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2　MS parameters of four nitrofuran metabolites and corresponding internal standards

2　結(jié)果與討論

2.1硝基呋喃代謝物的水解和衍生化反應(yīng)

硝基呋喃類抗生素在體內(nèi)迅速代謝，且代謝物以蛋白結(jié)合態(tài)形式存在于組織中，在適當(dāng)酸性條件下水解成游離態(tài)，所以本文選擇0.2 mol/L的鹽酸水溶液為水解液。4種硝基呋喃代謝物的相對分子量較小，離子化效率低，特征碎片離子少，且位于低質(zhì)量數(shù)范圍，質(zhì)譜背景干擾較大，檢測靈敏度低，直接進行質(zhì)譜測定較困難，故需進行衍生化反應(yīng)。一般采用鄰硝基苯甲醛作衍生劑［4-7］，但4種代謝物衍生化效率不同（衍生化效率為68%～75%）［8］，衍生條件對定量結(jié)果影響較大，所以應(yīng)嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生條件的一致。衍生物見光極易分解，應(yīng)避光衍生過夜，使質(zhì)譜信號達到最大值。

2.2LC-MS-MS分析

通過ESI+模式對4種目標(biāo)化合物及4種內(nèi)標(biāo)化合物進行全掃描，找出準(zhǔn)分子離子峰（M+H），并且以此準(zhǔn)分子離子峰為母離子改變碰撞電壓進行轟擊，進行二級質(zhì)譜掃描，找出2個信號較強的碎片離子構(gòu)成監(jiān)測離子對（見表2）。AHD碎片離子的掃描見圖1。

圖1AHD準(zhǔn)分子離子和碎片離子質(zhì)譜圖Fig.1　Quasi-molecular and fragment ions of CV

從圖1上可以看出，AHD的M/Z為 103.9和133.9兩個碎片離子的響應(yīng)信號較強，以這兩個碎片離子和準(zhǔn)分子離子峰構(gòu)成監(jiān)測離子對。通過改變透鏡電壓，使母離子最大效率通過一級質(zhì)譜進入二級質(zhì)譜進行碰撞，對碎片離子的碰撞能量進行優(yōu)化，提高碎片離子的響應(yīng)強度。

AHD準(zhǔn)分子離子透鏡電壓優(yōu)化曲線和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線見圖2。

在流動相中加入適量的甲酸、乙酸和低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽得到更加豐富的離子碎片信息，改善峰形，提高測定的靈敏度，本文在流動相水中加入0.1%甲酸，獲得良好的效果，以MRM模式對待測物質(zhì)進行定性定量分析。

混標(biāo)溶液MRM圖見圖3。

圖2　AHD準(zhǔn)分子離子透電壓優(yōu)化曲線和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線Fig.2　Optimizing curves of AHD quasi-molecular ion tube lens and fragment ion collision energy

圖3　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖Fig.3　Ion chromatogram of extract in mixed standard solution

2.3pH和光照的影響

在衍生化完成后進行萃取操作時，溶液的pH對萃取效率影響很大。試驗發(fā)現(xiàn)，不同pH條件下，4種硝基呋喃代謝物的衍生物的萃取效率不同。pH在7.1～7.5之間萃取效率最高，4種代謝物衍生物的萃取效率均達到90%以上，而AHD和AMOZ受pH的影響最大，pH小于4時，AMOZ不能從水相轉(zhuǎn)移到有機相中，而pH大于8時，AHD的萃取效率極低，所以，應(yīng)調(diào)節(jié)pH成弱堿性（7.1～7.5）時，各組分的萃取效率最高［8］。水解液為0.2 mol/L鹽酸水溶液，直接用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.1～7.5時，由于不同樣品的酸度有差異，體系沒有緩沖容量，調(diào)節(jié)pH在最佳萃取范圍較困難。在水解液中加入2 mL 0.5 mol/L的K2HPO4溶液，具有一定緩沖容量，再用1 mol/L氫氧化鈉溶液較易調(diào)節(jié)pH在7.1～7.5之間，保證萃取效率，減少定量誤差。

將濃度相同的硝基呋喃代謝物衍生物分別放置在光照和避光條件下，考察光照的影響，發(fā)現(xiàn)4種代謝物的衍生物對光敏感，且敏感程度不一致。AHD對光線最不敏感，光照下放置6 h后含量基本不變，而AMOZ對光照最敏感，放置6 h后幾乎完全分解，AOZ 和SEM相對穩(wěn)定，但放置后也出現(xiàn)不同程度的分解，而避光放置的硝基呋喃代謝物衍生的溶液含量基本不變，因此在整個樣品前處理應(yīng)在避光的條件下進行，減少分解，提高測定靈敏度，避免假陰性的出現(xiàn)。

2.4標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

分別吸取0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液50、100、200、400、800、1 000 μL于50 mL離心管中，分別加入混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，其余操作步驟同1.2樣品的處理，氮吹定容至1.00 mL，即得5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0 ng/mL的濃度系列，其中混合同位素內(nèi)標(biāo)含量為10 ng/mL按優(yōu)化的儀器條件進行測定。用峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，AHD：y=0.046 2x+ 0.020 2（r=0.999 9）；AMOZ：y=0.044 68x+0.049 0（r= 0.999 8）；AOZ：y=0.049 89x+0.013 7（r=0.999 6））；SEM：y=0.041 6x-0.003 9（r=0.999 3），結(jié)果表明4種代謝物在2.5 μg/kg～50 μg/kg的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 3。以各目標(biāo)物在陰性樣品中的3S/N計算該方法的檢出限，4種代謝物的檢出限為0.2 μg/kg。

2.5方法回收率及精密度試驗

取2.00 g陰性樣品于50 mL塑料離心管中，分別加入2.0、20.0、40.0 ng混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 ng混合內(nèi)標(biāo)溶液，即陰性樣品中4種硝基呋喃代謝物分別為1.0、10.0、20.0 μg/kg和內(nèi)標(biāo)物為5.0 μg/kg，低、中、高3個添加水平，渦旋混均，放置過夜吸收，按照上述樣品處理方法水解、凈化、上機測定，該方法回收率及精密度見表3。

表3　回收率及精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 3　Result of recoveries and precision

3　結(jié)論

本文通過水解、衍生、凈化測定魚肉中硝基呋喃代謝物的殘留量，方法的回收率在83.0%～101%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.2%～11.3%之間，檢出限為0.2 μg/kg，滿足魚肉中硝基呋喃代謝物的測定要求。該方法受pH和光照影響較明顯，所以在測定過程中應(yīng)嚴(yán)格控制試驗條件，同時加入同位素內(nèi)標(biāo)進行校正，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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Determination Metabolite Residue of Nitrofuran in Fish by UPLC-MS/MS

ZHOU Yi-bing1，WU Kun2，LI Lei1，LIN Ye1，LIU Li-ya1，*
（1.Guizhou Center for Diseases Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2.Guizhou Normal College，Guiyang 550018，Guizhou，China）

AHD，AMOZ，AOZ，SEM residues in fish were detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The samples were hydrolyzed by hydrochloric acid，was derivated by 2-NB at 37℃after 16 h and then added with 2 mL 0.5 mol/L dipotassium hydrogen phosphate，adjusted pH to 7.1-7.5 with sodium hydroxide，extracted by ethyl acetate，nitrogen evaporated，the mobile phase volumed.Electrospray ionization source was applied and operated in positive ion mode，using MRM scanning and internal standard method for quantitative analysis.Four metabolites showed a good linear correlation between 2.5 μg/kg to 50 μg/kg concentration with range coefficient greater than 0.999 3 and the lowest detection limit 0.2 μg/kg.The average recovery（n=6）of the samples at three levels（1，10，20 μg/kg）ranged from 83.0%to 101%with the relative standard deviation between 4.2%and 11.3%.The method used isotope internal standard for determination which corrected influence of incomplete derivation，decomposition by the light and solution pH on the extraction efficiency and improved the accuracy of quantitative results.The method was applicable to screening and confirmation of four nitrofuran metabolites in fish.

nitrofuran metabolites；fish；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.041

周貽兵（1985—），男（漢），副主任技師，碩士，研究方向：食品分析。
*

劉利亞，男，副主任技師，學(xué)士，主要從事于食品分析、保健品和化妝品檢驗檢測。

2015-04-01