沈衛(wèi)陽(yáng)，王潔瓊，王 婉，于清峰，肖 瑩*（中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198）

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柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定地溝油中的脂肪醛

沈衛(wèi)陽(yáng)，王潔瓊，王 婉，于清峰，肖 瑩*
（中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198）

研究利用油脂中的不飽和脂肪酸在提煉過(guò)程中發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、產(chǎn)生低分子脂肪醛的特點(diǎn)，采用柱前衍生化-高效液相色譜法，以2，4-二硝基苯肼為醛的衍生化試劑、2-甲基吡啶硼烷為還原劑，通過(guò)測(cè)定脂肪醛類物質(zhì)來(lái)檢測(cè)食用油中是否摻入了地溝油。結(jié)果表明：與食用油相比，精制地溝油中甲醛、乙醛的含量顯著增加，可據(jù)此判斷樣品是否為地溝油。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，極大地優(yōu)化了地溝油的檢測(cè)與鑒定流程。

地溝油；脂肪醛；2，4-二硝基苯肼；高效液相色譜

近年來(lái)，媒體多次報(bào)道地溝油經(jīng)回收、加工重新流入食用油市場(chǎng)，由于地溝油質(zhì)量和衛(wèi)生較差，并且其中有害物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo)［1-2］，可誘發(fā)多種疾病甚至致癌［3-4］。目前質(zhì)檢部門對(duì)食用油的檢測(cè)主要是理化指標(biāo)檢查［5-6］，如膽固醇含量［7］、電導(dǎo)率［8-9］、脂肪酸相對(duì)不飽和度［10］、易揮發(fā)成分烷烴［11］、酸價(jià)、羰基值、鈉氯離子含量［12-14］、皂化值、過(guò)氧化值、碘值、重金屬含量、三酰甘油聚合物、氧化三酰甘油［15-17］等指標(biāo)。但這些常規(guī)方法流程多、耗時(shí)長(zhǎng)，特異性不強(qiáng)，且精制的地溝油均符合規(guī)定，給質(zhì)檢部門和相關(guān)機(jī)構(gòu)帶來(lái)很大的困擾。因此如何快速有效鑒別和檢測(cè)食用油中是否混入地溝油，正成為研究的熱點(diǎn)。

地溝油提煉自經(jīng)加工過(guò)的普通食用油脂，其主要成分為高級(jí)脂肪酸甘油酯，在地溝油的加工、提煉過(guò)程中受氧氣、高溫等因素的作用，其中的不飽和脂肪酸甘油酯會(huì)發(fā)生水解及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)［18-19］，進(jìn)一步裂解形成食用油中本身不含的脂肪醛類物質(zhì)［20-21］?；谠撛恚瓨?shù)清等［22-23］使用2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrobenzene hydrazine，DNPH）作為醛的衍生化試劑，應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)精煉地溝油進(jìn)行了檢測(cè)。然而DNPH與脂肪醛反應(yīng)時(shí)會(huì)生成C=N雙鍵的順、反異構(gòu)體，這會(huì)使分析結(jié)果不準(zhǔn)確，降低檢測(cè)靈敏度。Uchiyama等［24-25］研究表明，2-甲基吡啶硼烷（2-picoline borane，2-PB）可選擇性還原C=N雙鍵，使C=N雙鍵順、反異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為相同結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用DNPH衍生化、2-PB還原后用HPLC法測(cè)定地溝油中脂肪醛的方法，對(duì)食用油及地溝油中可能含有的飽和脂肪醛進(jìn)行檢測(cè)并定量，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可為地溝油的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同批次食用油（福臨門葵花籽油）購(gòu)于南京市超市，且已開(kāi)啟包裝；粗制地溝油為某食堂餐廚垃圾中的上層油脂漂浮物經(jīng)過(guò)過(guò)濾和加熱除水后的殘留物，精制地溝油是取粗制地溝油參考董樹(shù)清等［22-23］的方法自制。

乙醛（≥99.5%）、丙醛（≥99.5%）、丁醛（≥99.5%）、戊醛（98%）、己醛（≥99.0%）、庚醛（≥98%）、辛醛（99%）、壬醛（96%）、癸醛（97%） 上海阿拉丁公司；衍生化試劑DNPH（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-PB絡(luò)合物（95%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純） 默克股份兩合公司；水為超純水；純氮（≥99.99%） 南京上元工業(yè)氣體廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC儀（包括1379脫氣機(jī)、1312二元泵、1314紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；TS-100恒溫混勻儀 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；XK-1200型離心機(jī) 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合醛標(biāo)準(zhǔn)品衍生化反應(yīng)

1.3.1.1 混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別取一定量的乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙腈配成20 mmol/L混合醛儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋10 倍，得到2 mmol/L的混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱中待用。

1.3.1.2 混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化反應(yīng)及產(chǎn)物的還原

取2 mmol/L混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL與2 mmol/L DNPH-乙腈溶液350 μL按物質(zhì)的量比1∶7混合，加入0.2 mol/L磷酸溶液30 μL，加乙腈至1 000 μL，將混合液在600 r/min、60 ℃條件下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入0.5 mol/L 2-PB-乙腈溶液300 μL、85%的磷酸溶液10 μL，繼續(xù)反應(yīng)1 h，用氮吹法將溶劑吹干，殘留物用65%的乙腈1 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取20 μL續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

1.3.2 供試油樣的收集與制備

1.3.2.1 地溝油的采集與精煉

參考董樹(shù)清等［22］的方法，將收集的廢油先用棉花過(guò)濾，濾液加熱除水，得粗制地溝油。在2.5 mL粗制地溝油中加入1 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，油樣迅速變混濁，出現(xiàn)白褐色絮狀物，再加入0.5 mL 10%氯化鈉溶液靜置過(guò)夜，油樣分層。分層后的油樣加入一定量活性炭，在115 ℃油浴中靜置30 min后過(guò)濾得到金黃色透明的精制地溝油，其外觀與食用油基本一致。

1.3.2.2 供試樣品的制備

取食用油、粗制地溝油、精制地溝油各200 μL，分別加入正己烷200 μL、2 mmol/L DNPH-乙腈溶液570 μL、0.2 mol/L磷酸溶液30 μL，混勻，在600 r/min、60 ℃條件下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中分別加入0.5 mol/L 2-PB的乙腈溶液300 μL、85%磷酸溶液10 μL，繼續(xù)反應(yīng)1 h。還原后的溶液用少量乙腈萃取3 次，合并萃取液，將萃取液用氮?dú)獯蹈?，殘留物?5%的乙腈500 μL溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，各取20 μL續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

1.3.3 HPLC條件

色譜柱為T h e r m o B D S H Y P E R S I L C1 8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相：甲醇與水梯度洗脫（0～7 min，甲醇65%～72%；7～48 min，甲醇72%～95%）。

1.3.4 供試樣品分析

取供試樣品20 μL分別注入HPLC儀中，以保留時(shí)間定性，按試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量方法分析

DNPH與脂肪醛反應(yīng)生成腙時(shí)，由于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有C=N雙鍵而形成順?lè)串悩?gòu)體，從而影響脂肪醛類化合物的準(zhǔn)確定量。Uchiyama等［24-25］的研究表明，2-PB可選擇性還原C=N雙鍵為C—N單鍵，使順?lè)串悩?gòu)體轉(zhuǎn)化為相同結(jié)構(gòu)，反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)圖1。因此本實(shí)驗(yàn)將DNPH-脂肪醛衍生物用2-PB進(jìn)行還原，不但簡(jiǎn)化了色譜圖，而且能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定脂肪醛的含量?；旌先?biāo)準(zhǔn)品經(jīng)DNPH衍生化后進(jìn)樣的色譜圖見(jiàn)圖2A，由于C=N雙鍵的存在導(dǎo)致產(chǎn)物中出現(xiàn)異構(gòu)體，且隨著碳鏈變長(zhǎng)，異構(gòu)體含量也逐漸增加。而衍生物經(jīng)2-PB還原后色譜圖見(jiàn)圖2B，兩個(gè)異構(gòu)體被還原為單一產(chǎn)物，其保留時(shí)間與還原前相比略有提前，但完全成為單峰，因而簡(jiǎn)化了色譜圖，便于脂肪醛的準(zhǔn)確定量。

圖1 DNPH與脂肪醛的反應(yīng)及2-PB對(duì)DNPH-醛衍生物的還原過(guò)程Fig.1 Aliphatic aldehydes derivatization with 2，4-dinitrophenylhydrazine and reduction of DNPH-aldehydes derivates with2-PB

圖2 混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng) DN PH 衍生化 （ A）及衍生化后經(jīng)2-P B還原 （B ）的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of: A） DNPH-aldehydes derivates of a standard aldehydes mixture ， and B） reductive products of DNPH-aldehydes derivates using2-picoline borane as reducing agent

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)C7～C10脂肪醛在食用油和地溝油中含量極低，無(wú)益于鑒別地溝油，因此選擇C2～C6脂肪醛作為考察指標(biāo)，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

2.2.1 線性關(guān)系

取2 mmol/L C2～C6混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成2.4、5.0、10、20、50、100 μmol/L，與DNPH按1∶7物質(zhì)的量比混合，按1.3.1.2節(jié)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)和還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用氮?dú)鈱⑷軇┐蹈桑瑲埩粑镉?5%的乙腈1 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取20 μL續(xù)濾液進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，表明各脂肪醛濃度與衍生物峰面積的線性關(guān)系良好，該方法克服了直接使用2，4-二硝基苯腙作為對(duì)照時(shí)由于反應(yīng)產(chǎn)率不同而造成的誤差。

表1 線性關(guān)系、進(jìn)樣精密度及加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 L in ear relati on ships， precisi on （RSDs） of i njecti on and spiked reco ve ries of ac etalde hy de ，p ro pa nal，b utanal ，p en tanal and hex anal

2.2.2 檢測(cè)限

取線性關(guān)系中2.4 μmol/L混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化反應(yīng)后的溶液，按信噪比3∶1測(cè)定各脂肪醛的檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。其中乙醛的檢測(cè)限顯著高于其他醛，可能是由于乙醛沸點(diǎn)較低，配制溶液過(guò)程中易揮發(fā)，導(dǎo)致其濃度下降所致。

2.2.3 進(jìn)樣精密度

取20 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)混合醛衍生反應(yīng)液還原后，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，結(jié)果見(jiàn)表1，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性

取200 μL食用油樣品，共平行5 份，按1.3.2.2節(jié)方法制備樣品，分別進(jìn)樣分析。由于食用油中主要含乙醛［22-23］，本實(shí)驗(yàn)以乙醛含量為指標(biāo)，測(cè)得食用油中乙醛含量為53.0 μmol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%。

2.2.5 加樣回收率

取200 μL食用油樣品，精密加入2 mmol/L混合醛標(biāo)準(zhǔn)溶液40 μL，按樣品衍生化方法處理，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，各脂肪醛的加樣回收率在81.1%～98.3%之間。

2.3 供試樣品測(cè)定結(jié)果

還原后的樣品溶液呈渾濁狀態(tài)，為便于測(cè)定，先將樣品離心分層，再用乙腈萃取3 次后，用氮吹法揮干乙腈，殘留物用65%乙腈500 μL溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，食用油、粗制地溝油和精制地溝油平行操作，色譜圖見(jiàn)圖3，結(jié)果見(jiàn)表2。

油脂中的脂肪醛主要來(lái)自多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，因此食用油在制備、貯存過(guò)程中也會(huì)進(jìn)行緩慢的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生少量的脂肪醛。而地溝油經(jīng)過(guò)高溫加熱、堿洗、脫色等處理，可能產(chǎn)生更多的脂肪醛。本實(shí)驗(yàn)采用DNPH衍生化、2-PB還原結(jié)合HPLC法對(duì)食用油、自制的粗制地溝油和精制地溝油中的脂肪醛含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，食用油僅含有少量C2～C6脂肪醛，粗制地溝油中乙醛含量明顯增加，而C3～C6脂肪醛含量變化不顯著。精制地溝油經(jīng)過(guò)堿化、活性炭吸附等步驟，使得乙醛含量有所降低，但所含的短鏈脂肪醛的種類反而增多，而且與食用油相比，精制地溝油中乙醛含量顯著高于食用油（表2）。此外，粗制地溝油和精制地溝油色譜圖中保留時(shí)間5.7 min的色譜峰（圖3B、C）顯著高于食用油，根據(jù)保留時(shí)間判斷可能為甲醛。選用37%甲醛溶液進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)該色譜峰為甲醛衍生物，但因無(wú)準(zhǔn)確濃度的甲醛對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其進(jìn)行定量分析。與食用油相比，精制地溝油色譜圖中保留時(shí)間為8.2 min和10.6 min處的色譜峰明顯增加，可能為不飽和脂肪醛類或酮類衍生物（圖3A、C）。因此精制地溝油中顯著增加的甲醛、乙醛和其他不飽和醛的檢測(cè)與定量可作為鑒別地溝油的指標(biāo)。

圖3 食用油（A）、粗制地溝油（B）和精制地溝油（C）的色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of edible oil （A）， crude waste cooking oil （B）， and refined waste cooking oil （C） after derivatization with DNPH and reduction with2-PB

表2 食用 油、粗制 地溝 油、精制 地溝 油測(cè) 定結(jié) 果（n=3）Table 2 Results for determ in ati on of aliphaticaldehydesi nedible oil，cr ude w aste coo k in g oil and ref in e waste co ok in g o il（n =3 ）

3 結(jié) 論

本研究中采用DNPH作為醛的衍生化試劑，以2-PB為還原劑，可以有效改善因生成異構(gòu)體而導(dǎo)致的定量不準(zhǔn)確的問(wèn)題，取食用油樣品直接進(jìn)行衍生化、還原，乙腈萃取后直接進(jìn)樣分析，使檢測(cè)流程更加簡(jiǎn)捷、快速。本方法還可以避免因反應(yīng)產(chǎn)率造成的結(jié)果偏低的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)HPLC法測(cè)定脂肪醛類物質(zhì)，來(lái)檢測(cè)食用油中是否摻入了地溝油的方法是可行的，并且準(zhǔn)確度好、靈敏度很高，可以為地溝油的檢測(cè)提供參考。

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［25］ UCHIYAMA S， INABA Y， KUNUGITA N.Derivatization of carbonyl compounds with 2，4-dinitrophenylhydrazine and their subsequent determination by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography B， 2011， 879: 1282-1289.DOI:10.1016/ j.jchromb.2010.09.028.

Determination of Aliphatic Aldehydes in Waste Cooking Oil by Pre-Column Derivatization-HPLC Method

SHEN Weiyang， WANG Jieqiong， WANG Wan， YU Qingfeng， XIAO Ying*
（School of Science， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China）

By taking advantage of lipid peroxidation of unsaturated fatty acids and consequent generation of a variety of highly reactive small molecular aliphatic aldehydes during the refining of waste cooking oil， a simple and highly sensitive method was established based on the precolumn derivatization of aliphatic aldehydes utilizing 2，4-dinitrobenzene hydrazine （DNPH） followed by high performance liquid chromatography （HPLC）.Further， high sensitivity was obtained by adding 2-picoline borane （2-PB） as a reducing agent to convert cis- and trans-isomers into the same structure.Compared with edible oil， the contents of formaldehyde and acetaldehyde in refined waste oil increased significantly， providing an indicator to discriminate waste cooking oil.This method is specific， highly sensitive and accurate and greatly improves the procedure for detection and identification of waste cooking oil.

waste cooking oil； aliphatic aldehyde； 2，4-dinitrobenzene hydrazine； high performance liquid chromatography （HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201614028

TS229

A

1002-6630（2016）14-0160-05

沈衛(wèi)陽(yáng)， 王潔瓊， 王婉， 等.柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定地溝油中的脂肪醛［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 160-164.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614028. http://www.spkx.net.cn

SHEN Weiyang， WANG Jieqiong， WANG Wan， et al.Determination of aliphatic aldehydes in waste cooking oil by pre-column derivatization-HPLC method［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 160-164.（in Chinese with English abstract）

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614028. http://www.spkx.net.cn

2015-10-26

中國(guó)藥科大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140654）

沈衛(wèi)陽(yáng)（1970—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樗幬锓治?。E-mail：wyshen@hotmail.com

*通信作者：肖瑩（1977—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樗幬锓治觥-mail：xyxyhello@sina.com