王金賓，金東昊，黃成成，孫浩然，陳 帥，李緒彥

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

大豆GmMYB138A基因的克隆及冷脅迫誘導(dǎo)表達分析

王金賓，金東昊，黃成成，孫浩然，陳 帥，李緒彥

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

根據(jù)大豆基因組信息，從大豆品種吉林32中克隆了1個轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因?qū)?yīng)大豆基因組中的CDS Glyma02g03020。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的蛋白屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子類型，主要分布在細胞核中；進化樹分析將它與1R-MYB蛋白聚為一類，并與大豆MYB138親緣關(guān)系最近，同源性可達96%，將其命名為GmMYB138A；進一步利用qRT-PCR分析GmMYB138A響應(yīng)冷脅迫的表達模式，結(jié)果表明隨著脅迫處理時間的延長，該基因表達逐漸增加，并在脅迫24 h達到高峰，提示GmMYB138A可能參與大豆的冷脅迫應(yīng)答過程。

大豆；GmMYB138A；克??；冷脅迫；基因表達

王金賓，金東昊，黃成成，等.大豆GmMYB138A基因的克隆及冷脅迫誘導(dǎo)表達分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（6）：43-48.

MYB蛋白是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中并發(fā)揮著重要的作用［1］。MYB轉(zhuǎn)錄因子含有兩個重要的功能區(qū)域，一個是N端保守MYB結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合特定的DNA序列；另一個是C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，用于決定MYB蛋白對基因表達正/負調(diào)節(jié)作用。MYB結(jié)構(gòu)域通常包含1～3個串聯(lián)的、不完全重復(fù)的R序列（R1、R2和R3），每個重復(fù)的R序列含有52個左右的氨基酸，形成3個α螺旋，進而組成具有疏水核心的HTH（螺旋-折疊-螺旋）結(jié)構(gòu)，其中第3 個α螺旋作為識別螺旋，直接與DNA結(jié)合并插入到DNA大溝中［2］。在與DNA直接作用過程中，通常是2個識別螺旋協(xié)同作用從而結(jié)合特定的DNA基序［3］。

植物MYB 轉(zhuǎn)錄因子首先在玉米中得到鑒定［4］，隨著多個植物基因組測序的完成大量的MYB基因被分離鑒定，例如擬南芥有198個MYB，水稻有242個MYB，甜橙有177個MYB［5-7］。根據(jù)不完全重復(fù) R序列的數(shù)量，這些植物MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為4類，分別為1R-MYB（R1/R2，R3-MYB）、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB （R1R2R2R1/R2-MYB）［8］。與動物中MYB蛋白的主要存在形式不同，植物MYB轉(zhuǎn)錄因子大多屬于R2R3-MYB類型，而其他3類MYB轉(zhuǎn)錄因子（1R、3R和4R MYB）類型所占比例相對較少［8-10］。這些MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、光周期、細胞周期、初次生代謝、激素和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中發(fā)揮著重要的作用［8，11-12］。隨著人們對逆境脅迫影響植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的認識，MYB轉(zhuǎn)錄因子在逆境應(yīng)答中的作用也倍受關(guān)注。目前在擬南芥、水稻、小麥、大豆、甘蔗等多個物種中分別克隆到許多逆境應(yīng)答相關(guān)的MYB基因，如AtMYB2、AtMYB15、AtMYB41、AtMYB44、AtMYB61、AtMYB77、AtMYB102、OsMYB4、OsMYB2、OsMYB55、TaMYB1、TaMYB2A、TaMYB33、GmMYBJ1和 ScMYBAS1等。這些MYB基因在植物響應(yīng)干旱、熱、低溫、鹽、損傷等脅迫中發(fā)揮著重要的作用［8，13-19］，然而這些逆境應(yīng)答相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子大多都是R2R3-MYB類蛋白。近年來在植物中鑒定了幾個與逆境應(yīng)答相關(guān)的R1-MYB蛋白，如AtMYBC1能夠負調(diào)控擬南芥的耐凍能力［20］，OsMYBS3和Jc1RMYB1分別參與了水稻和麻風(fēng)樹響應(yīng)低溫脅迫的過程［21-22］，TaLHY在小麥對條銹病的抗性方面發(fā)揮著重要的作用［23］，羊草的LcMYB1基因能夠提高擬南芥的耐鹽能力［24］。這些研究結(jié)果表明1R-MYB也參與植物的逆境應(yīng)答過程，然而目前關(guān)于1R-MYB在植物響應(yīng)逆境方面的研究相對較少，需要挖掘更多逆境應(yīng)答相關(guān)的1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子并闡釋其作用機理。

本研究在大豆中克隆了1個1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB138A，并利用生物信息學(xué)手段對其編碼蛋白的理化特性及進化特性進行了分析，進一步對其在低溫脅迫下基因表達模式進行了分析，推測該基因可能參與大豆早期響應(yīng)低溫脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。該研究提供了大豆GmMYB138A的初步信息，這為深入開展GmMYB138A基因功能研究（尤其在低溫應(yīng)答方面）奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為吉林32。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆冷脅迫處理 取大豆品種吉林32種子，用15%的次氯酸鈉消毒 20 min，然后用無菌水清洗 4～6 次，將種子種在土和蛭石（3∶1）的缽中，在人工氣候室內(nèi)（溫度24℃，光照12 h）培養(yǎng)，定時通風(fēng)，定時澆灌營養(yǎng)液，待種子出苗后，每缽保留生長健壯、大小一致的幼苗 2 株。播種后14 d開始對幼苗進行4℃低溫脅迫處理：分別在第0、24、48、60、66 h將正常生長的幼苗移至低溫人工氣候室（4℃，光照12 h）進行冷脅迫培養(yǎng)，72 h后分別收集不同時間點處理的幼苗整株組織作為冷脅迫處理72、48、24、12、6 h 的材料，并以正常培養(yǎng)的同齡幼苗為對照0h處理，液氮速凍后貯于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成 取大豆幼苗和低溫脅迫處理的整株幼苗組織在液氮中研磨，分別稱取0.1 g組織粉末，利用RNAisoPlus試劑（TaKaRa）提取幼苗組織中的RNA，其提取流程按照試劑說明書進行。提取的RNA經(jīng)RNase-Free DNase處理，除去其中的基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/OD280比值判斷RNA的完整性與質(zhì)量。取完整性與質(zhì)量良好的RNA，利用PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成 cDNA模板，其方法與流程按照說明書進行，所得cDNA模板用于后續(xù)基因克隆與實時定量PCR檢測。

1.2.3 RT-PCR克隆GmMYB138A基因 根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫（www.phytozome.net）中發(fā)布的基因組序列信息，通過搜索，根據(jù)所得序列設(shè)計特異引物，MYB138AF：5' -ATGTCTCGCACGTGCTCA-3'，MYB138A -R： 5'- AGCAACGCTGATGATACTATCC -3'。以上述所得cDNA為模板，利用高保真酶Ex Taq（TaKaRa）進行PCR擴增。PCR程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pGMT載體（TIANGEN）上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ，由北京華大基因中心進行測序。

1.2.4 GmaMYB138A的生物信息學(xué)分析 通過測序獲得大豆品種吉林32 GmaMYB138A的基因序列后，利用以下在線軟件對其編碼蛋白的理化及結(jié)構(gòu)特性進行分析：利用Compute pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi）對GmaMYB138A蛋白分子量和等電點進行分析；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對該蛋白的基本性質(zhì)進行分析；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODLE （http：//swissmodel.expasy.org/interactive）對其三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析；利用SignalP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)序列中信號肽的剪切位點；利用PSORT （http：//www.psort.org/）預(yù)測蛋白亞細胞定位；不同物種的MYB蛋白序列來自NCBI （www.ncbi.nlm.nih.gov），運用MEGA5.02 軟件對GmaMYB138A蛋白及其同源蛋白進行進化樹分析。

1.2.5 GmaMYB138A在冷脅迫下的基因表達分析 運用PrimerBLAST設(shè)計GmaMYB138A基因與內(nèi)參基因SUBI3的特異性引物，其序列分別為qMYB138F2：5'- GCGCAAGCGAGGTGTTCCTT-3'，qMYB138R2：5'- CGCCATCGTTTCTTGCGGAA-3'，擴增片段長度為237 bp；SUBI3-F：5'-GTGTAAT GTTGGATGTGTTCCC-3'，SUBI3-R：5'-ACACAA TTGAGTTCAACACAAACCG-3'，擴增片段長度為190 bp。采用SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒（TaKaRa），并按照說明書對反應(yīng)體系進行設(shè)置。運用ABI7500熒光定量 PCR 儀及其軟件系統(tǒng)進行熒光定量PCR檢測與分析。以大豆SUBI3基因為內(nèi)參，計算GmaMYB138A基因相對表達量2-ΔΔCt。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆MYB138A基因的克隆及序列分析

通過phytozome網(wǎng)站（www.phytozome.net） 對大豆基因組進行在線搜索，以所得序列為參考設(shè)計特異性引物，以大豆品種吉林32的cDNA為模板對目的基因進行克隆（圖1）。測序分析表明，其CDS 全長為903 bp，對應(yīng)大豆基因組中的Glyma02g03020，編碼300個氨基酸，分子量為32.16 ku，等電點為9.86。

2.2 大豆MYB138A蛋白特性預(yù)測

利用ProtParam在線工具對該基因編碼蛋白氨基酸特性進行分析，結(jié)果顯示該MYB蛋白含14.0%堿性氨基酸殘基（K、R和H），8.0%酸性氨基酸殘基（D、E），28.2.%疏水氨基酸殘基（A、I、L、F、W、V），29.9%極性氨基酸殘基（N、C、Q、S、T、Y），其中堿性氨基酸含量高于酸性氨基酸，說明該MYB蛋白為堿性蛋白。通過SOPMA和SWISS-MODEL分別對該蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三級結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果表明該MYB蛋白由4種二級結(jié)構(gòu)組成（圖2A），其中α螺旋為主、占31.7%，β折疊、無規(guī)則卷曲以及β轉(zhuǎn)角分別占29.7%、27.3%、11.3%，具有典型的HTH（螺旋-折疊-螺旋）結(jié)構(gòu)（圖2A、B）。利用SMART在線工具對該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示第91～141位氨基酸組成1個典型的SANT/MYB-like結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)為1R-MYB蛋白特點。除此外，該蛋白在第4～20位氨基酸還含有ZnF_C2H結(jié)構(gòu)域（圖2C）。

圖1 大豆MYB138A的RT-PCR擴增結(jié)果

圖2 GmMYB138A蛋白二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

利用PSORT對該MYB蛋白進行亞細胞定位分析，結(jié)果表明該蛋白主要分布在細胞核中，這與MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致。利用NetNES對該蛋白的信號肽進行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白的247～253位氨基酸（LPLSLNL）是典型的富含亮氨酸的核運輸信號肽。利用STRING10預(yù)測可能與該MYB蛋白發(fā)生相互作用的因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可能與MYB114和MBY118相互作用，而MYB114與下胚軸延遲伸長和生物鐘相關(guān)。

圖3 大豆MYB138A蛋白與其它MYB蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

圖4 大豆MYB138A與其他1R-MYB蛋白序列同源比對分析

2.3 大豆MYB138A蛋白同源性比對分析

為了研究該MYB蛋白與其它MYB蛋白的親緣關(guān)系，從NCBI中獲取了大豆、擬南芥和水稻中的一些1R-MYB類和R2R3-MYB類蛋白序列，利用MEGA5軟件構(gòu)建了進化樹。圖3結(jié)果表明這些MYB蛋白聚為兩類：1R-MYB蛋白類和R2R3-MYB蛋白類。我們鑒定的大豆MYB蛋白與R1-MYB蛋白聚為一類，并與GmMYB138表現(xiàn)為最近的親緣關(guān)系，而與GmMYB176、GmMYB62及擬南芥與水稻中的MYB蛋白親緣關(guān)系相對較遠（圖3）。進一步利用Clustal W 軟件將該MYB蛋白與1R-MYB蛋白序列進行比對，結(jié)果顯示該蛋白與大豆和綠豆（Vigna radiata var.radiata）中的R1-MYB蛋白相似性最高，其中與GmMYB138、GmMYB158、Gm01g04530和VrMYB1R1相似性分別達到96%、96%、89%和88%（圖4）。該蛋白與MYB138親緣關(guān)系最近、序列相似性最高，因此將該MYB蛋白命名為MYB138A。序列比對分析也表明這些1R-MYB蛋白在SANT結(jié)構(gòu)域的序列具有高度的保守性，而其他區(qū)域是否具有保守性與它們的進化關(guān)系呈正相關(guān)，進化關(guān)系較近的1R-MYB蛋白相互之間序列保守性較強，反之保守性較弱，這暗示1R-MYB類蛋白功能的多樣性和保守性。

2.4 大豆MYB138A在冷脅迫下的表達分析

前人的研究結(jié)果表明一些R1-MYB轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)低溫脅迫應(yīng)答，為了研究大豆MYB138A是否具有冷脅迫誘導(dǎo)特性，利用實時定量RT-PCR方法分析了該基因?qū)涿{迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，隨著冷脅迫GmMYB138A基因表達量開始增加，冷脅迫24 h時GmMYB138A基因表達量達到最高峰，與對照相比增加了5.39倍；然而隨著脅迫時間的延長，GmMYB138A基因表達量開始降低（圖5），這表明GmMYB138A基因表達受到冷脅迫誘導(dǎo)。

圖5 大豆MYB138A基因在冷脅迫條件下的表達模式

3 　討論

MYB蛋白是植物體內(nèi)存在最為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，其中 1R-MYB是MYB轉(zhuǎn)錄因子中重要的一個類型。盡管目前已經(jīng)在大豆、擬南芥、水稻、小麥等許多植物物種中鑒定了1R-MYB基因，它們在植物生長發(fā)育、次生代謝、逆境應(yīng)答等許多生理過程中發(fā)揮著重要的作用［19-24］，但是關(guān)于1R-MYB蛋白的研究相對較少。該研究在大豆中鑒定了1個1R-MYB基因，并對其冷脅迫誘導(dǎo)特性進行了分析，這為后期深入研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究從大豆中克隆 1 R-M Y B蛋白基因GmMYB138A，通過4個方面對其是否屬于1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員進行了分析。首先該基因編碼蛋白中α螺旋與β折疊所占比例很高，這與MYB結(jié)構(gòu)域具有HTH（螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋）結(jié)構(gòu)相一致；其次，生物信息學(xué)預(yù)測表明該蛋白主要定位在細胞核中，并且具有核運輸信號肽，這與MYB轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中發(fā)揮作用相一致；其三，該基因編碼蛋白具有典型的SANT/MYB-like蛋白結(jié)構(gòu)域，并且該SANT/MYB-like結(jié)構(gòu)域的序列具有高度的保守性；最后，該基因編碼的蛋白序列與大豆和綠豆中的一些1R-MYB蛋白具有高度同源性，與大豆中的1R-MYB型蛋白GmMYB138的同源性高達96%，說明我們在大豆中克隆的基因GmMYB138A為1R-MYB型蛋白基因。為了了解GmMYB138A的功能，分析了其與大豆、擬南芥、綠豆、水稻中MYB蛋白家族不同成員的系統(tǒng)進化關(guān)系，結(jié)果顯示GmMYB138A與1R-MYB聚為一類，并與大豆中的MYB138、MYB158、Gm01g04530親緣關(guān)系較近，這表明GmMYB138A的功能可能與MYB138、MYB158、Gm01g04530、VrMYB1R1相似，然而目前尚未見到這些蛋白功能的報道。

Liao等研究表明大豆受到冷、干旱、ABA處理后有43個MYB基因表達水平發(fā)生了變化［25］，說明大豆MYB基因在響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來也有關(guān)于1R-MYB參與響應(yīng)植物冷害或凍害的報道。例如水稻OsMYBS3通過抑制依賴于DREB1/CFB冷信號途徑介導(dǎo)水稻的低溫脅迫耐受機制［21］；擬南芥MYBC1通過不依賴于CFB冷信號途徑負調(diào)控凍害脅迫的耐受過程［20］，這說明不同的1R-MYB成員在冷/凍脅迫中所起的作用不同。本研究利用實時定量RT-PCR方法分析了GmMYB138A在冷脅迫下的基因表達情況，結(jié)果表明受到冷脅迫后GmMYB138A基因的表達量開始增加，在脅迫24 h時達到高峰，這與水稻OsMYBS3和麻風(fēng)樹Jc1RMYB1基因受低溫誘導(dǎo)的報道相一致［21-22］，表明GmMYB138A基因可能參與大豆的冷脅迫應(yīng)答過程，但是GmMYB138A在冷脅迫中的作用與功能還有待進一步研究。

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（責(zé)任編輯 鄒移光）

Cloning of GmMYB138A from Glycine max.and its expression analysis under cold stress

WANG Jin-bin，JIN Dong-hao，HUANG Cheng-cheng，SUN Hao-ran，CHEN Shuai，LI Xu-yan
（College of Plant Science，Jilin University，Changchun 130062，China）

According to the soybean genomic database，a transcription factor gene，GmMYB138A，was cloned from Glycine max.cv Jilin32.Bioinformatic analysis indicated that the protein encoded by this gene belonged to 1RMYB group，and was localized in nucleus.Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that GmMYB138A was clustered into the 1R-MYB group，evolutionarily closest to MYB138 from soybean，and the identity was up to 96%.Furthermore，q PCR analysis was conducted to examine its expression pattern in response to cold stress.As a result，the transcriptional level was gradually promoted with the cold treatment duration，and the peak occurred at 24h after cold stress，suggesting that GmMYB138A might be involved in the signaling transduction during cold stress.

soybean；GmMYB138A；cloning；cold stress；gene expression

S565.1

A

1004-874X（2016）06-0043-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.009

2016-01-08

國家自然科學(xué)基金（31300253）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2014A82371）

王金賓（1992-），男，在讀本科生，E-mail：2398885301@qq.com

李緒彥（1975-），女，博士， 副教授， E-mail：xuyanli@jlu.edu.cn