曾邦定，黃欽耿，梁　玲，郭小雷，王明茲，施巧琴，吳松剛

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黃色短桿菌ilvN基因定點(diǎn)突變和ilvBN、ilvC串聯(lián)表達(dá)對L-纈氨酸產(chǎn)量的影響

曾邦定1，黃欽耿1，梁玲2，郭小雷2，王明茲1，施巧琴1，吳松剛1

（1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117；2福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心，福建 福州 350008）

摘要:由ilvBN、ilvC基因編碼的乙酰羥酸合成酶（AHAS）和乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（AHAIR）是L-纈氨酸合成途徑的兩個關(guān)鍵酶。本實(shí)驗(yàn)以黃色短桿菌Brevibacterium flavum MD515為出發(fā)菌株，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增其ilvBN 和ilvC基因，對調(diào)節(jié)亞基ilvN進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得抗反饋抑制突變型編碼基因ilvBNrC；然后將其插入穿梭表達(dá)載體 pZ8-1中，構(gòu)建串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒 pZ8-1-ilvBNrC 并轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株，篩選獲得工程菌株 B.flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC。搖瓶發(fā)酵該工程菌株L-纈氨酸產(chǎn)量達(dá)29.5 g·L-1，較出發(fā)菌株提高27.7%，同時(shí)生長速度和生物量也比出發(fā)菌株有所提高，丙氨酸含量降低，L-亮氨酸及L-異亮氨酸含量提高。在30 L發(fā)酵罐連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵60 h后L-纈氨酸產(chǎn)量達(dá)61.7 g·L-1，糖酸轉(zhuǎn)化率為39.2%。菌株MD515/pZ8-1-ilvBNrC發(fā)酵液透光率較出發(fā)菌株高且蛋白含量低，這些特性有利于發(fā)酵液后期的分離提取。

關(guān)鍵詞:L-纈氨酸；定點(diǎn)突變；乙酰羥酸合成酶；乙酰羥酸異構(gòu)還原酶；共表達(dá)

引 言

L-纈氨酸(valine)是一種支鏈氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及調(diào)味劑、動物飼料和化妝品等行業(yè)[1-3]。目前，發(fā)酵法、直接提取法和化學(xué)合成法是工業(yè)生產(chǎn)L-纈氨酸的3種主要方法[4]。微生物發(fā)酵為首選，常用生產(chǎn)菌株主要由棒桿菌和短桿菌選育而來，其中以谷氨酸棒狀桿菌和黃色短桿菌為代表[5]。誘變和代謝工程育種在L-纈氨酸生產(chǎn)菌種選育中最為常用[6]。誘變育種操作簡單，技術(shù)要求低，但工作量大、周期長、突變不定向性及副產(chǎn)物雜酸多，提純成本高[6-7]。而基于理性設(shè)計(jì)的代謝工程育種可避免這些問題，目的性強(qiáng)、育種效率高，為L-纈氨酸高產(chǎn)菌株選育的最有效方法[8]。

L-纈氨酸生物合成與 L-異亮氨酸和 L-亮氨酸相關(guān)[9-11]，以丙酮酸為前體，經(jīng)過4步酶反應(yīng)而成，依次是乙酰羥酸合酶（AHAS，編碼基因 ilvBN）、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（AHAIR，編碼基因 ilvC）、二羥酸脫氫酶（DHAD，編碼基因ilvD）以及支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（TA，編碼基因ilvE）[12-13]（圖1）。其中AHAS是四聚體，含兩個ilvB基因編碼的大亞基（催化亞基）和兩個ilvN基因編碼的小亞基（調(diào)節(jié)亞基）[14]。它是合成途徑中的第一個限速酶，其調(diào)節(jié)亞基不僅受L-纈氨酸的反饋抑制，還受L-異亮氨酸和L-亮氨酸的協(xié)同阻遏[1, 11]。因此，解除3個支鏈氨基酸對 AHAS的多價(jià)阻遏可獲得 L-纈氨酸高產(chǎn)菌株。

圖1　L-纈氨酸的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of L-valine

Eli?áková等[15]將棒桿菌AHAS調(diào)節(jié)亞基22～24位Gly-Ile-Ile定點(diǎn)突變?yōu)锳sp-Asp-Phe，解除了反饋抑制。Hasegawa等[16]將棒桿菌 ilvN基因156位定點(diǎn)突變，由Gly變成Glu，也可提高抗反饋抑制能力。此外，ilvBN與ilvC為同一操縱子（ilvBNC），同時(shí)過表達(dá)可促進(jìn) L-纈氨酸積累。Eli?áková等[15]定點(diǎn)突變ilvN同時(shí)過表達(dá)ilvBNC，使谷氨酸棒桿菌L-纈氨酸的產(chǎn)量達(dá)15.2 g·L-1；Hasegawa等[16]敲除谷氨酸棒桿菌ldhA及過表達(dá)ilvBNCDE，結(jié)合工藝優(yōu)化后L-纈氨酸產(chǎn)量可達(dá)227 g·L-1；Hou等[14]在黃色短桿菌中串聯(lián)表達(dá)經(jīng)定點(diǎn)突變的 ilvEBNrC基因，L-纈氨酸達(dá)31 g·L-1。

本文以黃色短桿菌B. flavum MD515為出發(fā)菌株，先將ilvN基因定點(diǎn)突變，獲得抗反饋抑制突變型基因ilvBNrC，隨后將其插入穿梭表達(dá)載體pZ8-1，轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株，獲得過量積累 L-纈氨酸的工程菌B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC。然后搖瓶和30 L發(fā)酵罐分析其發(fā)酵性能，為工業(yè)化投產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 黃色短桿菌B. flavum MD515由福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心選育并保藏；穿梭表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1由福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心提供；質(zhì)粒 pMD-18T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4連接酶、PCR試劑及所用的Taq酶、dNTP、DNA Marker等均購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g·L-1）:葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，氯化鈉5，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基（g·L-1）:葡萄糖 25，黃豆餅粉35，玉米漿5，酵母膏5，硫酸銨5，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，CaCO310。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）:葡萄糖125，黃豆餅粉20，玉米漿5，酵母膏3，硫酸銨35，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·3H2O 0.01，CaCO335，VB1100 μg·L-1，VH100 μg·L-1。以上培養(yǎng)基pH均為7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃色短桿菌目的片段 ilvBNC的擴(kuò)增 根據(jù)谷 氨 酸 棒 桿 菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因序列，結(jié)合 L-纈氨酸的代謝途徑分析，設(shè)計(jì)上下游引物ilvBNC-F、ilvBNC-R。

其中引物ilvBNC-F和ilvBNC-R分別帶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線序列）。引物由上海生工生物有限公司合成。

以黃色短桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增ilvBNC基因。反應(yīng)體系為50 μl:ddH2O 35.5 μl，10×Ex buffer 5 μl，引物ilvBNC-F、ilvBNC-R各2.5 μl，基因組DNA模板1 μl，dNTP 2.5 μl，Ex Taq酶1 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，然后在以下條件下進(jìn)行30輪循環(huán):94℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸3 min；72℃最后延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，采用1%瓊脂糖電泳檢測，回收目的基因4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物長3700 bp。

1.2.2 pMD18-T-ilvBNC質(zhì)粒載體構(gòu)建及擴(kuò)增 根據(jù)Takara pMD18-T Vector使用說明連接，擴(kuò)增質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒pMD18-T-ilvBNC。

1.2.3 pMD18-T-ilvBNrC質(zhì)粒載體的構(gòu)建 為了將ilvN基因的第156位密碼子定點(diǎn)突變，以提取的質(zhì)粒pMD18-T-ilvBNC為模板，使用攜帶有突變位點(diǎn)的引物ilvBNrC-F和ilvBNrC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，定點(diǎn)突變后的基因命名為ilvBNrC。

ilvN基因PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變引物如下。

ilvBNrC-F:5′-CGAACTGATCCAATCCGAAC AGATTGCACTCAAC-3′。

ilvBNrC-R:5′-CGGATTGGATCAGTTCGCGG ATTCCGAATGGT-3′。

其中加粗的堿基為引入的第156位密碼子突變堿基。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min；然后在以下條件進(jìn)行12個循環(huán):94℃變性40 s；59℃退火1.5 min；72℃延伸6 min；72℃最后延伸20 min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1 μl DpnI 內(nèi)切酶37℃消化1 h，取20 μl消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證。構(gòu)建的重組載體命名為pMD18-T-ilvBNrC。

1.2.4 重組質(zhì)粒 pZ8-1-ilvBNrC的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將獲得的陽性pMD18-T-ilvBNrC質(zhì)粒和pZ8-1質(zhì)粒分別用 EcoRⅠ和 BamHⅠ雙酶切后回收質(zhì)粒與基因片段，并用 T4連接酶連接以構(gòu)建工程質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC。構(gòu)建原理如圖2所示。酶切體系60 μl:10×H buffer，6 μl；質(zhì)粒10 μl；EcoRⅠ2 μl ；BamHⅠ2 μl；ddH2O 40 μl；37℃酶切6 h。連接體系20 μl:10×T4 ligase buffer 2 μl；ilvBNrC片段2.5 μl；pZ8-1載體片段8 μl；T4 DNA ligase 1 μl；dd H2O 6.5 μl；16℃過夜連接。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，37℃復(fù)蘇1 h，取200 μl復(fù)蘇液涂布含50 μg·ml-1卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。從平板上挑選卡那霉素抗性的單克隆接種至含50 μg·ml-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證。

按照文獻(xiàn)[17]方法制備黃色短桿菌 MD515感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，篩選含有表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC的纈氨酸工程菌株，命名為 B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNrC。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析 所獲得的工程菌 B. flavum MD515/pZ8-1 -ilvBNrC經(jīng)搖瓶發(fā)酵后分析其L-纈氨酸含量、菌體生物量以及副產(chǎn)物雜酸的生成情況。培養(yǎng)條件為 30℃，220 r·min-1發(fā)酵 48 h，以 B. flavum MD515為對照菌株。氨基酸含量測定采用紙色譜法[18]和高效液相色譜法[19]。

1.2.6 30 L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵 種子液培養(yǎng):挑一環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至裝有30 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30℃，220 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長中后期。

補(bǔ)料發(fā)酵:初始裝液量為12 L，移種量15%，初始葡萄糖濃度約 70 g·L-1，發(fā)酵溶氧維持在15%～25%，初始攪拌轉(zhuǎn)速280 r·min-1，發(fā)酵溫度30℃，流加25%的氨水以控制pH在6.9～7.0，發(fā)酵期間每隔2 h取樣檢測菌體生物量及殘?zhí)?，根?jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量；當(dāng)殘?zhí)墙抵?.0～4.0 g·L-1時(shí)連續(xù)流加700 g·L-1的葡萄糖，維持殘?zhí)菨舛仍?～12 g·L-1，發(fā)酵結(jié)束前2～4 h，停止流加葡萄糖，當(dāng)殘?zhí)腔竞谋M時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵周期約60 h。

1.2.7 發(fā)酵液特性 發(fā)酵結(jié)束后，預(yù)處理、用有機(jī)膜過濾及離子交換法分離L-纈氨酸。具體操作按文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行，分別采用紫外可見分光光度計(jì)和考馬斯亮藍(lán)法測定透光率和蛋白濃度，比較工程菌發(fā)酵液雜蛋白等特性。

圖2　重組表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC構(gòu)建示意圖Fig.2 Maps of plasmid pZ8-1-ilvBNrC constructed

2　結(jié)果與討論

2.1 黃色短桿菌B. flavum MD515 ilvBNC基因的擴(kuò)增

從黃色短桿菌B. flavum MD515中提取DNA為模板，以ilvBNC-F和ilvBNC-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一段約3700 bp的產(chǎn)物（圖3）。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化涂布于含有Amp的LBG平板。待平板長出菌落后，隨機(jī)挑取10個單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，所挑取的10個單克隆均可檢測到約3700 bp的目的片段。

2.2 pMD18-T-ilvBNrC的構(gòu)建

采用 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變，以 pMD18-T-ilvBNC為模板對ilvN基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，同樣采取菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性克隆送交上海生工進(jìn)行測序。并將序列進(jìn)行Clustalx 序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的ilvBNrC基因與突變前ilvBNC基因的差異在于第156個密碼子核苷酸由GGA突變?yōu)镚AA，所編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)楣劝彼?，與定點(diǎn)突變設(shè)計(jì)目標(biāo)一致，表明pMD18-T-ilvBNrC構(gòu)建成功。

圖3　黃色短桿菌B. flavum MD515 ilvBNC基因PCR克隆Fig.3 PCR of ilvBNC fragment from B. flavum MD515M—DL 5000TMDNA Marker; lane 1,2—ilvBNC fragment

2.3 點(diǎn)突變串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC的構(gòu)建

pMD18-T-ilvBNrC質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，出現(xiàn)長度分別為3700 bp和2700 bp的條帶，回收3700 bp片段（圖4）。pZ8-1質(zhì)粒也經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，回收7000 bp左右的線性目標(biāo)產(chǎn)物片段。兩個酶切產(chǎn)物經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性平板上獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后分別進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果見圖5，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ分別單酶切后，均產(chǎn)生10700 bp條帶；而采用EcoRⅠ和BamHⅠ雙切后，出現(xiàn)大小為7000 bp和3700 bp的兩條帶，與設(shè)計(jì)結(jié)果一致，說明重組質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC構(gòu)建成功。

圖4　pMD18-T-ilvBNrC質(zhì)粒EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切Fig.4 Restriction enzyme digestion of pMD18-T-ilvBNrC by EcoRⅠand BamHⅠM—DL 5000TMDNA Marker; lane1,2,3,4—fragments of pMD18-T-ilvBNrC plasmid by EcoRⅠand BamHⅠdouble enzymatic digestion

圖5　重組表達(dá)質(zhì)粒pZ8-1-ilvBNrC的分子驗(yàn)證Fig.5 Molecular verification of recombinant plasmid pZ8-1-ilvBNrC

M—λ-EcoT14 I digest DNA Marker; lane 1—fragment of pZ8-1-ilvBNrC by EcoRⅠenzymatic digestion; lane 2—fragment of pZ8-1-ilvBNrC by BamH Ⅰenzymatic digestion; lane 3—fragment of pZ8-1-ilvBNrC plasmid by EcoRⅠ, BamHⅠdouble enzymatic digestion

2.4 工程菌株獲得及功能驗(yàn)證

將所構(gòu)建的點(diǎn)突變串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒 pZ8-1-ilvBNrC轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MD515，分離轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并以質(zhì)粒為模板，ilvBNrC-F和ilvBNrC-R為引物擴(kuò)增ilvBNrC，擴(kuò)增產(chǎn)物為3700 bp，與理論值一致（圖6，泳道1）；用EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒，獲得大小10700 bp的片段，與設(shè)計(jì)結(jié)果一致（圖6，泳道2）；用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒，獲得大小7000 bp和3700 bp的片段，也與設(shè)計(jì)結(jié)果一致（圖6，泳道3）。表明工程菌株B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC構(gòu)建成功。用同樣的方法將空白質(zhì)粒 pZ8-1及 pZ8-1-ilvBNC也分別轉(zhuǎn)化 B. flavum MD515菌，構(gòu)建對照菌株 B. flavum MD515/pZ8-1和B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNC。

圖6　重組菌株的分子驗(yàn)證Fig.6 Confirmation of recombinant strain by PCRM—λ-EcoT14 I digest DNA Marker; lane 1—PCR cloning of ilvBNrC fragment; lane 2—fragment of pZ8-1-ilvBNrC plasmid by EcoRⅠenzymatic digestion; lane 3—fragment of pZ8-1-ilvBNrC plasmid by EcoRⅠ, BamHⅠdouble enzymatic digestion

圖7　不同黃色短桿菌的發(fā)酵生長曲線Fig.7 Growth curves of MD515,MD515/pZ8-1,MD515/ pZ8-1-ilvBNC and MD515/ pZ8-1-ilvBNrC

2.5 工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分析

為了分析工程菌株B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNrC的L-纈氨酸及主要副產(chǎn)物合成情況，將其與兩個對照菌株B. flavum MD515/ pZ8-1和B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNC相同條件培養(yǎng)，結(jié)果見圖7和表1。

MD515/pZ8-1-ilvBNrC 菌株和 MD515/ pZ8-1-ilvBNC菌株生長速度及L-纈氨酸產(chǎn)量較MD515菌株有較大幅度提高；而轉(zhuǎn)入空載體的 MD515/ pZ8-1菌株L-纈氨酸產(chǎn)量低于出發(fā)菌株MD515，但生長速度和生物量較出發(fā)菌株高；另外對于副產(chǎn)物，MD515/pZ8-1的丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸含量與出發(fā)菌株接近，而 MD515/ pZ8-1-ilvBNC 和MD515/pZ8-1-ilvBNrC發(fā)酵液中丙氨酸含量顯著降低，異亮氨酸和亮氨酸的含量則有所提高，說明ilvN的定點(diǎn)突變及ilvBN、ilvC的串聯(lián)表達(dá)不僅影響菌株的生長，對L-纈氨酸及其他氨基酸的生物合成及代謝調(diào)控也有一定影響，尤其對同一合成途徑的支鏈氨基酸——異亮氨酸和亮氨酸。而對于提高L-纈氨酸產(chǎn)量，ilvBNC的串聯(lián)表達(dá)較ilvN點(diǎn)突變具有更顯著作用。

表1　MD515/ pZ8-1-ilvBNrC發(fā)酵性能比較Tabal 1 Comparison of fermentation properties of MD515/ pZ8-1-ilvBNrC

2.6 工程菌株MD515/pZ8-1-ilvBNrC在30 L發(fā)酵罐上的生產(chǎn)性能

在 30 L發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵驗(yàn)證菌株MD515/pZ8-1-ilvBNrC的生產(chǎn)性能。發(fā)酵過程代謝曲線見圖8，其L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)61.7 g·L-1，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)39.2%，發(fā)酵穩(wěn)定，較對照菌株菌體密度更大，而且可以提前產(chǎn)酸時(shí)間，該工程菌已實(shí)現(xiàn)120 t罐正常工業(yè)化生產(chǎn)。

工程菌株MD515/pZ8-1-ilvBNrC的發(fā)酵液陶瓷膜過濾效率優(yōu)于出發(fā)菌株，發(fā)酵液透光率高于MD515，其雜蛋白含量0.85 g·L-1，遠(yuǎn)低于MD515 的1.48 g·L-1，也表明MD515/pZ8-1-ilvBNrC菌株較MD515更高效地利用培養(yǎng)基營養(yǎng)，純化效率更高。

圖8　菌株B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC 分批補(bǔ)料發(fā)酵代謝曲線Fig.8 Metabolism curve of strain B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNrC in fed batch fermentation

3　結(jié) 論

以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，設(shè)計(jì)構(gòu)建了工程菌株MD515/pZ8-1-ilvBNrC，結(jié)果其L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸等3個支鏈氨基酸的含量均比出發(fā)菌株MD515提高，而丙氨酸的含量下降，表明ilvN的定點(diǎn)突變及ilvBN、ilvC基因的串聯(lián)表達(dá)對黃色短桿菌L-纈氨酸的代謝流有明顯影響。該結(jié)果可能與競爭支路丙氨酸的合成量減少有關(guān)，表達(dá)抗反饋抑制的AHAS和AHAIR可能促進(jìn)丙酮酸更多地轉(zhuǎn)入L-纈氨酸合成支路而減少了丙氨酸合成。結(jié)果還表明ilvBNC的串聯(lián)表達(dá)較ilvN的156位堿基定點(diǎn)突變對提高L-纈氨酸產(chǎn)量影響更大。研究還發(fā)現(xiàn)ilvN定點(diǎn)突變及ilvBN、ilvC的串聯(lián)表達(dá)有利于提高菌株的菌體生物量，這對于菌株提前發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)間，縮短發(fā)酵周期，達(dá)到高密度發(fā)酵具有意義。而且工程菌株發(fā)酵液透光率較出發(fā)菌株要高，雜蛋白含量更低，這對發(fā)酵液后期的分離提取非常有利。

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2015-12-21收到初稿，2016-04-17收到修改稿。

聯(lián)系人:王明茲。第一作者:曾邦定（1990—），男，碩士研究生。

Received date: 2015-12-21.

中圖分類號:Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:0438—1157（2016）07—2956—07

DOI:10.11949/j.issn.0438-1157.20151935

Corresponding author:WANG Mingzi, mingziw@fjnu.edu.cn

Effects of Brevibacterium flavum with directed mutagenesis of ilvN and co-expression of ilvBNC cluster on L-valine production

ZENG Bangding1, HUANG Qingeng1, LIANG Ling2, GUO Xiaolei2, WANG Mingzi1, SHI Qiaoqin1, WU Songgang1
(1College of Life Sciences, Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, Fujian, China;2Fuzhou Research Center of Fujian Maidan Biology Group Co., Ltd., Fuzhou 350008, Fujian, China)

Abstract:Acetohydroxy acid synthase (AHAS) and acetohydroxy acid isomeroreductase (AHAIR) encoded by ilvBN and ilvC are two key enzymes which play important roles in the biosynthetic pathway of L-valine. Brevibacterium flavum MD515 was used as the origin strain and site-specific mutagenesis was performed in its ilvN gene which coded for the regulatory subunit of AHAS, resulting in the obtainment of an anti-feedback inhibition gene, named ilvBN'C. Then, the ilvBNrC gene was ligased to plasmid pZ8-1 for construction of the recombinant plasmid pZ8-1-ilvBNrC, which was subsequently transfored into B. flavum MD515. With this method, the targeted transformant B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC showed better L-valine producing capacity of 29.5 g·L-1, 27.7% increase than that of original strain when it was cultured in 250 ml shake flasks. Meanwhile, the yield of leucine and isoleucine also increased while the alanine decreased. The biomass and growth rate were also increased. Moreover, fermentation experiments was performed in a 30 L fermentor and the results indicated thatthe L-valine productivity of B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC reached to 61.7 g·L-1while the conversion rate of glucose/valine was up to 39.2%. The work finally made some simple investigations about the purification of L-valine in B. flavum MD515/ pZ8-1-ilvBNrC and B. flavum MD515. The results showed that the light transmittance of strain B. flavum MD515/pZ8-1-ilvBNrC was higher while the protein content was lower than that of B. flavum MD515, which was beneficial for subsequent separation process.

Key words:L-valine; site-specific mutagenesis; acetohydroxy acid synthase; acetohydroxy acid isomeroreductase; co-expression