尹學(xué)哲　王玉嬌　尹基峰　全吉淑

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林　延吉　133000)

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草蓯蓉多糖對(duì)過氧化氫損傷HepG2細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

尹學(xué)哲王玉嬌1尹基峰全吉淑1

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探討草蓯蓉多糖(BRPS)對(duì)過氧化氫(H2O2)損傷的HepG2細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB表達(dá)的影響。方法以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，采用蛋白印跡法檢測(cè)NF-κB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、血紅素氧合酶(HO)-1、環(huán)氧化酶(COX)-2以及核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的蛋白表達(dá)。結(jié)果H2O2損傷HepG2細(xì)胞后，NF-κB p65和Nrf2蛋白水平升高，iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高。BRPS處理可降低HepG2細(xì)胞NF-κB p65水平，對(duì)Nrf2蛋白水平無顯著影響。BRPS同時(shí)降低iNOS、HO-1蛋白水平，但對(duì)COX-2蛋白水平無影響。結(jié)論BRPS降低H2O2損傷的HepG2細(xì)胞iNOS、HO-1蛋白水平，這可能與降低NF-κB活化有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕草蓯蓉多糖；過氧化氫；氧化損傷；HepG2；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB參與炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡等病理生理過程的基因調(diào)控〔1〕，其與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系一直是肝臟疾病研究中的熱點(diǎn)〔2〕。研究證實(shí)，急性肝損傷時(shí)伴隨著NF-κB的活化，通過NF-κB通路激活肝臟Kupffer細(xì)胞，從而造成腫瘤壞死因子(TNF)-α和Fas等基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，造成肝功能損害〔2〕。草蓯蓉又名不老草，具有補(bǔ)腎壯陽、滋補(bǔ)強(qiáng)身、潤(rùn)腸止血、延年益壽的功效，具有抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫、抗炎及抗腫瘤等作用〔3～5〕。草蓯蓉多糖(BRPS)是草蓯蓉重要活性成分，前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)過氧化氫(H2O2)所致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用，減輕其細(xì)胞損傷〔6〕。本實(shí)驗(yàn)擬探索BRPS對(duì)損傷HepG2細(xì)胞NF-κB及下游炎性蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑BRPS：醇沉法提取，含量70%〔6〕。人HepG2細(xì)胞：南京凱基生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基及小牛血清：Gibco公司；兔NF-κB多克隆抗體、兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗體、小鼠血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體、兔環(huán)氧化酶(COX)-2多克隆抗體、兔核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)多克隆抗體：美國Abcam公司。

1.2主要儀器3-30K型離心機(jī),Sigma公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一儀器廠；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽，美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀，美國UVP公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組〔5,6〕HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活躍的細(xì)胞進(jìn)行分組。對(duì)照組換入正常培養(yǎng)液；加入H2O2，使其濃度為300 μmol/L；BRPS組中加入BRPS使其濃度達(dá)到50 mg/L，2 h后再加入300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷12 h〔5,6〕。

1.4蛋白印跡法檢測(cè)NF-κB以及相關(guān)炎性蛋白的表達(dá)收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，以20 μg蛋白為上樣量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯(PVDF)膜上。封閉后，一抗孵育過夜，然后用相應(yīng)二抗耦聯(lián)物反應(yīng)1 h，增強(qiáng)化學(xué)光法(ECL)顯跡，在凝膠成像分析儀中采集圖像并進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞NF-κB和IκB蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，H2O2組HepG2細(xì)胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，BRPS組HepG2細(xì)胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05)。見圖1。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下圖同圖1　BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞NF-κB和IκB蛋白表達(dá)的影響

2.2BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，H2O2組HepG2細(xì)胞iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，BRPS組iNOS、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，COX-2蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。見圖2。

圖2　BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

2.3BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞核Nrf2蛋白含量增高(P<0.05)；BRPS處理對(duì)細(xì)胞核Nrf2蛋白含量有增高趨勢(shì)，但無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖3　BRPS對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

3討論

H2O2是一種非?；钴S的強(qiáng)氧化劑，能引發(fā)一系列的氧化反應(yīng)進(jìn)而影響甚至破壞細(xì)胞的正常新陳代謝，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷；同時(shí)產(chǎn)生一系列自由基，激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而介導(dǎo)細(xì)胞炎癥和凋亡，加重細(xì)胞損傷〔7〕。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白因子，活性氧可以直接激活NF-κB；活化的NF-κB即可進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)各種炎癥介質(zhì)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞損傷〔8〕。因此，NF-κB途徑被認(rèn)為是炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激可引起肝細(xì)胞NF-κB蛋白活化，使其核轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，導(dǎo)致其下游相關(guān)炎性因子iNOS、HO-1、COX-2蛋白表達(dá)上調(diào)。說明NF-κB激活可使肝細(xì)胞炎癥相關(guān)靶基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥，造成肝功能損害。而BRPS處理可降低肝細(xì)胞NF-κB活化，核轉(zhuǎn)移減少，下調(diào)iNOS和HO-1蛋白表達(dá)，從而降低細(xì)胞炎癥和損傷。在本研究中，BRPS對(duì)肝細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)無顯著影響，是否還存在其他因素影響COX-2表達(dá)還有待研究。此外，HO-1的表達(dá)受多種信號(hào)途徑的共同調(diào)控〔9〕。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，對(duì)HO-1具有重要的調(diào)節(jié)作用〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷HepG2細(xì)胞核Nrf2蛋白水平升高，但BRPS對(duì)核Nrf2蛋白水平無顯著影響。提示，BRPS下調(diào)HO-1蛋白表達(dá)可能是由NF-κB介導(dǎo)的，與Nrf2無關(guān)。

綜上所述，BRPS能夠抑制肝細(xì)胞NF-κB活化和核轉(zhuǎn)移，使其介導(dǎo)的炎癥相關(guān)的靶基因表達(dá)下調(diào)，這有助于其降低細(xì)胞炎癥和細(xì)胞損傷。

4參考文獻(xiàn)

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7張祎，陳文，孟憲麗.三黃瀉心湯對(duì)全腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激及炎性損傷的保護(hù)作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2014；30(4):1-5.

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〔2015-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160539；81360651)

通訊作者：全吉淑(1968-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3108-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.007

Effect of Boschniakia Rossica polysaccharides on expression of NF-κB in H2O2-damaged HepG2 cells

YIN Xue-Zhe,WANG Yu-Jiao,YIN Ji-Feng,et al.

Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of polysaccharides from Boschniakia rossica(BRPS)on expressiion of nuclear factor(NF)-κB in H2O2-damaged HepG2 cells.MethodsThe protein expressions of NF-κB, inducible nitric oxide synthase(iNOS), heme oxygenase(HO)-1, cyclooxygenase(COX)-2 and nuclear factor erythroid2-related factor 2(Nrf2)were determined by Western blot. ResultsDuring the oxidative damage, nuclear levels of NF-κB p65 and Nrf2 proteins were increased, and the protein expressions of iNOS, HO-1 and COX-2 were up-regulated. The administration of BRPS reduced the nuclear NF-κB p65 level while there was no significant change of Nrf2 protein. BRPS also down-regulated the protein expressions of iNOS and HO-1, but had no significant effect on COX-2. ConclusionsBRPS could reduce the levels of iNOS and HO-1 proteins, probably via the reduction of NF-κB activation.

【Key words】Boschniakia rossica; H2O2; Oxidative damage; HepG2; NF-κB

1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院

第一作者：尹學(xué)哲(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。