張永坡，呂佳苑，楊佳佳，白雪，王玉峰，高燁，趙晉忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801)

?

喹啉類(lèi)鋅配合物的合成、結(jié)構(gòu)及化學(xué)核酸酶活性的研究

張永坡，呂佳苑，楊佳佳，白雪，王玉峰，高燁，趙晉忠*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]探索配合物對(duì)DNA的斷裂作用，尋找新型高效的核酸斷裂試劑。[方法]設(shè)計(jì)合成了一例未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的基于喹啉骨架的二羧酸單核鋅(II)配合物[ZnL(H2O)3]·H2O。運(yùn)用元素分析、紅外吸收光譜方法表征了該配合物，并利用X-射線單晶衍射儀解析其單晶結(jié)構(gòu)，利用瓊脂糖凝膠電泳手段研究了其化學(xué)核酸酶活性。[結(jié)果]解析結(jié)構(gòu)表明配合物中Zn(II)中心為七配位的畸變五角雙錐結(jié)構(gòu)；配合物表現(xiàn)出一定程度的切割DNA活性。[結(jié)論]本研究為設(shè)計(jì)合成新型高效、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的化學(xué)核酸酶提供有價(jià)值的研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：喹啉類(lèi)配體；鋅配合物；晶體結(jié)構(gòu)；DNA切割

天然核酸酶無(wú)論從品種、數(shù)量、價(jià)格還是對(duì)堿基對(duì)的特異性識(shí)別方面均不能滿(mǎn)足現(xiàn)今急速增長(zhǎng)的需要，因此人工合成各種新穎的化學(xué)核酸酶成為科研工作者們的重要任務(wù)[1～3]。另一方面，許多天然核酸酶在表達(dá)其活性時(shí)需要金屬離子的激活，這使得金屬配合物作為人工化學(xué)核酸酶的研究自上世紀(jì)八十年代以來(lái)逐漸發(fā)展成為生物無(wú)機(jī)化學(xué)的一個(gè)熱門(mén)研究領(lǐng)域[4～9]。1979年Sigman等[10]報(bào)道了第一個(gè)雙1，10-鄰菲啰啉銅化學(xué)核酸酶，科研工作者們對(duì)金屬配合物的核酸酶活性的研究興趣隨之迅速上升。特別是近十幾年來(lái)，人們對(duì)其理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了廣泛、深入的研究和拓展，開(kāi)發(fā)出了一系列可用于DNA結(jié)構(gòu)探針、DNA斷裂試劑、分子光誘導(dǎo)開(kāi)關(guān)、細(xì)胞示蹤試劑以及抗腫瘤藥物等領(lǐng)域的化學(xué)核酸酶[8,9]。

喹啉類(lèi)衍生物作為一類(lèi)具有廣泛生物活性的含氮雜環(huán)化合物，具有良好的生物活性，在其結(jié)構(gòu)中引入不同取代基將會(huì)改變或增強(qiáng)其活性[11,12]。此外喹啉還可以與金屬離子形成穩(wěn)定的配合物，在金屬藥物的合成與研發(fā)中占有重要的地位。鋅(Zn)是生命體中不可缺少的元素，廣泛存在于300多種酶中[13]。Zn2+具有低毒性、氧化還原惰性及較高的生物利用度等特點(diǎn)。因此人們將Zn(II)配合物作為重點(diǎn)研究的人工化學(xué)核酸酶試劑和潛在的治療性藥物[14～17]。

為了進(jìn)一步探索配合物對(duì)DNA的斷裂作用，尋找新型高效的核酸斷裂試劑。本文設(shè)計(jì)了一種全新的喹啉二羧酸衍生物配體(見(jiàn)圖1)，合成了一例未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的單核鋅配合物，解析了其晶體結(jié)構(gòu)，利用瓊脂糖凝膠電泳手段檢測(cè)配合物的化學(xué)核酸酶活性，結(jié)果表明該化合物表現(xiàn)出一定程度的切割DNA的活性。本項(xiàng)研究為設(shè)計(jì)合成新型高效、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的化學(xué)核酸酶以及為深入探討小分子金屬配合物作為核酸斷裂試劑及潛在治療性藥物的作用機(jī)理提供了有價(jià)值的研究基礎(chǔ)。

圖1　配體L的合成路線圖Fig.1　Synthesis of L (sodium 8-(carboxylatomethoxy)quinoline-2-carboxylate)

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

所用化學(xué)試劑和藥品均為市售分析純產(chǎn)品?；瘜W(xué)核酸酶活性測(cè)試所用的Tris、EDTA、NaCl、H3BO3等均為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?。pBR322DNA(BR) 購(gòu)自Fermentas公司；溴化乙錠(EB)(AR)，瓊脂糖為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

紅外吸收光譜、元素分析(C，H，N)、單晶衍射分析分別用PerkinElmerFT-IRSpecturmTwo型傅立葉變換紅外光譜儀、Perkin-Elmer240型元素分析儀、BrukerSmart1000衍射儀測(cè)定。

所涉及凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及成像實(shí)驗(yàn)分別用恒壓DYY-III型電泳儀及UVItec自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行。

1.2化合物的合成

1.2.1配體L的合成

配體L的合成參照文獻(xiàn)[18]描述的方法進(jìn)行改進(jìn)。稱(chēng)取2.4g2-甲基-8-羥基喹啉(15mmol)，2.5g溴乙酸乙酯(15mmol)依次溶于30mL丙酮中并不斷攪拌，緩慢加入8gK2CO3粉末(58mmol)，回流24h。冷卻至室溫后過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得油狀粗產(chǎn)品。干燥后將其溶于25mL二氧六環(huán)中并不斷攪拌，緩慢加入1.8gSeO2(16mmol)，回流12h。冷卻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，往體系中加入50mL0.5mol·L-1稀HCl，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層合并后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得油狀粗產(chǎn)品。將其溶入25mL乙醇中并不斷攪拌，緩慢加入10mLNaOH溶液(4.5mol·L-1)，回流2h，往體系中加入25mL乙醇后冷卻，有深黃色沉淀析出，用95%乙醇重結(jié)晶，產(chǎn)率為47%。元素分析/%，理論值(C12H7NNa2O5):C, 49.50;H, 2.42;N, 4.81. 實(shí)驗(yàn)值:C, 49.41;H, 2.67;N, 4.79.FT-IR(KBr, ν,cm-1): 3 348, 1 615, 1 507, 1 480, 1 421, 1 385, 1 315, 1 265, 1 107, 824.

1.2.2配合物[ZnL(H2O)3]·H2O的合成

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2mmol的配體L，用10mL無(wú)水甲醇溶解，經(jīng)恒壓滴液漏斗緩慢滴加10mL的ZnCl2(27mg, 0.2mmol)的水溶液，混合物在室溫下攪拌3h后過(guò)濾，濾液于室溫靜置，緩慢揮發(fā)溶劑10d后，適合于X-射線衍射測(cè)試的黃色棱狀晶體析出，將晶體過(guò)濾并用少量冷的乙醚淋洗，干燥后稱(chēng)重，產(chǎn)率為40%。元素分析/%，理論值(C12H15NO9Zn)：C, 37.67;H, 3.95;N, 3.66. 實(shí)驗(yàn)值：C, 37.59;H, 4.02;N, 3.62.FT-IR(KBr, ν,cm-1): 3 355, 1 620, 1 508, 1 470, 1 421, 1 398, 1 381, 1 316, 1 267, 1 110, 821。

1.3配合物的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

挑選適合于X-射線單晶衍射的晶體(0.40mm×0.25mm×0.10mm)，在室溫下(293K)，使用經(jīng)石墨單色化的MoKα輻射作為入射光源(λ= 0.071 073nm)，以ω-2θ連續(xù)掃描方式收集所有獨(dú)立的衍射點(diǎn)。在解析過(guò)程中，衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)用SADABS程序校正。用各向異性熱參數(shù)法對(duì)所有非氫原子進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正，氫原子則由幾何理論加氫程序自動(dòng)添加。全部計(jì)算利用SHELXTL程序包完成。相關(guān)晶體學(xué)數(shù)據(jù)分別列于表1和表2中。

表1　配合物的晶體學(xué)參數(shù)

1.4化學(xué)核酸酶活性實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1緩沖溶液的配制

緩沖液均用三次蒸餾水配制，配制方法參照文獻(xiàn)[19]中描述方法。電泳實(shí)驗(yàn)在緩沖溶液1(含50mmol·L-1Tris和18mmol·L-1NaCl，pH=7.2)和TBE電極緩沖液(含44mmol·L-1Tris，44mmol·L-1H3BO3和1mmol·L-1EDTA，pH= 8.3)中進(jìn)行。

1.4.2瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

用三次蒸餾水配制0.9%的瓊脂糖凝膠，其中EB的濃度為0.5mg·L-1。在終止劑中加入少量溴酚藍(lán)以指示電泳的進(jìn)程?；緦?shí)驗(yàn)步驟：在2mL樣品管中依次加入一定量的pBR322DNA(濃度為0.1g·L-1)，一定濃度的配合物溶液及一定體積的緩沖溶液1，輕微震蕩混勻。將樣品管置于恒溫水浴中(37 ℃)恒溫3h后，加入2μL反應(yīng)終止液，再次混勻，使反應(yīng)液的最終體積保持為20μL。將樣品加到瓊脂糖凝膠槽中，120V恒壓條件下在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，最后經(jīng)UVItec自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1配合物的晶體結(jié)構(gòu)

晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明：該配合物屬于三斜晶系，P-1空間群(見(jiàn)圖2)，其基本結(jié)構(gòu)單元由一個(gè)[ZnL(H2O)3]和外界的一個(gè)H2O構(gòu)成。配合物中Zn(II)中心為七配位模式，配位原子由一個(gè)喹啉N原子、一個(gè)酚醚O原子、兩個(gè)羧酸根O原子及三個(gè)水分子O原子構(gòu)成，其幾何構(gòu)型可描述為畸變的五角雙錐結(jié)構(gòu)。相關(guān)晶體學(xué)參數(shù)列于表1中，配合物的主要鍵長(zhǎng)和鍵角數(shù)據(jù)列于表2中。

圖2　配合物[ZnL(H2O)3]·H2O的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.2　Crystal structure of the complex

在鋅配位中心中，五個(gè)原子N1、O1、O2、O6、O7占據(jù)平面位置，從表2中可知圍繞鋅中心的處于五角平面的五個(gè)鍵角(63.40(13)～81.36(16)°)之和為360.04°；而O4和O5原子則占據(jù)軸位置，O(5)-Zn(1)-O(4)鍵角為173.33(15)°。此外，Zn(1)-O(1) 鍵長(zhǎng)(0.2557(4)nm)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它六個(gè)配位鍵長(zhǎng)(0.2062(3)～0.2277(4)nm)(見(jiàn)表2)，表明Zn(1)-O(1)為弱配位鍵。

2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配合物對(duì)質(zhì)粒DNA的斷裂反應(yīng)

在近生理?xiàng)l件下(Tris-HCl/NaCl緩沖液，pH=7.2，37 ℃)，恒溫3h，通過(guò)改變配合物濃度，檢測(cè)質(zhì)粒DNA的斷裂程度。圖3所示為不加任何誘導(dǎo)劑，配合物切割pBR322DNA(0.1mg·L-1)的凝膠電泳圖。泳道0：質(zhì)粒DNA空白對(duì)照；泳道1～5：DNA+配合物(50, 200, 350, 500, 650μmol·L-1)。泳道0為DNA空白，F(xiàn)ormIDNA(閉環(huán)超螺旋型DNA)的含量約為98%，說(shuō)明質(zhì)粒DNA的純度較高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用。泳道1～5配合物在實(shí)驗(yàn)濃度50～650μmol·L-1范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的FormIIDNA(開(kāi)環(huán)缺刻型DNA)出現(xiàn)，表明濃度為650μmol·L-1的配合物未表現(xiàn)出切割DNA的能力，即質(zhì)粒DNA未發(fā)生斷裂開(kāi)環(huán)。

表2　配合物的部分鍵長(zhǎng)/nm和鍵角/°數(shù)據(jù)

圖3　不加誘導(dǎo)劑,不同濃度配合物切割pBR322 DNA的凝膠電泳圖Fig.3　In the absence of inducer, gel electrophoresis diagram showing the cleavage of pBR322 DNA at different complex concentrations

圖4所示為在同等實(shí)驗(yàn)條件下，恒溫3h，加入誘導(dǎo)劑過(guò)氧化氫(H2O2)后，不同濃度的配合物切割pBR322DNA(0.1g·L-1)的凝膠電泳圖。泳道0：DNA空白對(duì)照；泳道1：DNA+0.25mmol·L-1H2O2；泳道2～5：DNA+H2O2+配合物(5, 20, 35, 50μmol·L-1)。泳道1沒(méi)有明顯的FormIIDNA出現(xiàn)，說(shuō)明H2O2本身對(duì)DNA不發(fā)生切割作用，可作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用?？梢钥闯黾尤胝T導(dǎo)劑過(guò)氧化氫后，隨著配合物濃度的增大，其切割DNA的能力有較大的提高。配合物的濃度在35μmol·L-1時(shí)有約46%的FormII(開(kāi)環(huán)缺刻型DNA)產(chǎn)生，說(shuō)明配合物具有斷裂DNA的能力；當(dāng)濃度增大至50μmol·L-1時(shí)，有近50%的FormII產(chǎn)生。結(jié)果表明過(guò)氧化氫作為誘導(dǎo)劑發(fā)揮著重要的作用，使得配合物的切割DNA能力有很大的提高。

圖4　加入誘導(dǎo)劑后，不同濃度配合物切割pBR322 DNA的凝膠電泳圖Fig.4　In the presence of inducer (H2O2), gel electrophoresis diagram showing the cleavage of pBR322 DNA at different complex concentrations

3討論與結(jié)論

3.1討論

近幾十年來(lái)，化學(xué)核酸酶在模擬天然核酸酶、DNA斷裂試劑等方面的研究已成為化學(xué)和生物學(xué)中最為活躍的前沿領(lǐng)域之一。DNA是重要的生命遺傳物質(zhì)，被認(rèn)為是藥物作用的主要生物靶點(diǎn)。探討DNA與小分子間的相互作用，以及與藥物作用機(jī)理之間的聯(lián)系，對(duì)于藥物設(shè)計(jì)與合成以及新藥的開(kāi)發(fā)與研究，都有重要的意義。

DNA切割即通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將長(zhǎng)鏈的DNA分子斷裂成較短的片段。本文設(shè)計(jì)合成了一例新型的以喹啉衍生物為配體的單核鋅配合物[ZnL(H2O)3]·H2O，在過(guò)氧化氫的誘導(dǎo)活化下，較低濃度(35μmol·L-1)的配合物就可以表現(xiàn)出良好的切割DNA的能力。這歸因于喹啉類(lèi)衍生物作為一類(lèi)具有廣泛生物活性及藥理活性的含氮雜環(huán)化合物，具有大的平面芳環(huán)結(jié)構(gòu)。在喹啉結(jié)構(gòu)中引入含N、O配位原子的官能團(tuán)與金屬形成穩(wěn)定的配合物，使其能與DNA相互作用。此外，低毒的配位中心金屬Zn(II)自身較高的生物利用度也使得該配合物與DNA的作用能力增強(qiáng)。

目前，配合物作為人工核酸酶在DNA的定點(diǎn)切割方面研究還具有較大的挑戰(zhàn)，因此，進(jìn)一步探索新配合物對(duì)DNA的斷裂和識(shí)別機(jī)理，尋找新型高效的核酸定點(diǎn)斷裂試劑則會(huì)是我們未來(lái)的研究工作重點(diǎn)之一。

3.2結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一例未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的喹啉衍生物配體、相應(yīng)單核鋅配合物[ZnL(H2O)3]·H2O，運(yùn)用元素分析、紅外吸收光譜方法對(duì)其進(jìn)行表征，并利用X-射線單晶衍射儀解析了配合物的單晶結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)表明Zn(II)中心為七配位的畸變五角雙錐結(jié)構(gòu)，其中Zn(1)-O(1)為弱配位鍵。利用瓊脂糖凝膠電泳手段檢測(cè)了其化學(xué)核酸酶活性，結(jié)果顯示配合物在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)劑作用下表現(xiàn)出了一定程度的切割DNA活性。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究喹啉及其衍生物過(guò)渡金屬配合物與DNA的相互作用，發(fā)現(xiàn)高效化學(xué)核酸酶斷裂試劑和研發(fā)金屬類(lèi)治療性藥物，具有一定的理論和實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)

[1]MancinF,ScriminP,TecillaP,etal.Artificialmetallonucleases[J].ChemCommun, 2005 (20): 2540-2548.

[2]AibaY,SumaokaJ,KomiyamaM.ArtificialDNAcuttersforDNAmanipulationandgenomeengineering[J].ChemSocRev, 2011, 40(12): 5657-5668.

[3]PalermoG,CavalliA,KleinML,etal.CatalyticmetalionsandenzymaticprocessingofDNAandRNA[J].AccChemRes, 2015, 48(2): 220-228.

[4]LeungCH,HeHZ,LiuLJ,etal.Metalcomplexesasinhibitorsoftranscriptionfactoractivity[J].CoordChemRev, 2013, 257(21): 3139-3151.

[5]LiuHK,SadlerPJ.MetalcomplexesasDNAintercalators[J].AccChemRes, 2011, 44(5): 349-359.

[6]KomorAC,BartonJK.ThepathformetalcomplexestoaDNAtarget[J].ChemCommun, 2013, 49(35): 3617-3630.

[7]LiGY,GuanRL,JiLN,etal.DNAcondensationinducedbymetalcomplexes[J].CoordChemRev, 2014, 281: 100-113.

[8]PagesBJ,AngDL,WrightEP,etal.MetalcomplexinteractionswithDNA[J].DaltonTrans, 2015, 44(8): 3505-3526.

[9]MjosKD,OrvigC.Metallodrugsinmedicinalinorganicchemistry[J].ChemRev, 2014, 114(8): 4540-4563.

[10]SigmanDS,GrahamDR,D'auroraV,etal.Oxygen-dependentcleavageofDNAbythe1, 10-phenanthrolinecuprouscomplex.InhibitionofEscherichiacoliDNApolymerase[J].JBioChem, 1979, 254(24): 12269-12272.

[11]田俊鋒，劉軍，孫旭峰，等. 具有生物活性的喹啉類(lèi)化合物的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2011，50(8)：552-557.

[12]陳廣明，吳志兵，胡德禹，等. 喹啉及其衍生物的合成與生物活性研究進(jìn)展[J]. 精細(xì)化工中間體，2011，41(2)：1-5.

[13]KolenkoV,TeperE,KutikovA,etal.Zincandzinctransportersinprostatecarcinogenesis[J].NatRevUrol, 2013, 10(4): 219-226.

[14]PucciD,CrispiniA,MendiguchíaBS,etal.ImprovingthebioactivityofZn(II)-curcuminbasedcomplexes[J].DaltonTrans, 2013, 42(26): 9679-9687.

[15]MendiguchiaBS,PucciD,MastropietroTF,etal.Non-classicalanticanceragents:onthewaytowatersolublezinc(ii)heterolepticcomplexes[J].DaltonTrans, 2013, 42(19): 6768-6774.

[16]SinghR,AfzalM,ZakiM,etal.Synthesis,structureelucidationandDFTstudiesofanewcoumarin-derivedZn(ii)complex:invitroDNA/HSAbindingprofileandpBR322cleavagepathway[J].RSCAdv, 2014, 4(82): 43504-43515.

[17]GaoCY,QiaoX,MaZY,etal.Synthesis,characterization,DNAbindingandcleavage,BSAinteractionandanticanceractivityofdinuclearzinccomplexes[J].DaltonTrans, 2012, 41(39): 12220-12232.

[18]ZhengQ,WangS,LiuW.Discoveryandefficientsynthesisofabiologicallyactivealkaloidinspiredbythiostreptonbiosynthesis[J].Tetrahedron, 2014, 70(42): 7686-7690.

[19]高春艷，馬小芳，寇瑩瑩，等. 酪氨酸過(guò)渡金屬配合物的合成、結(jié)構(gòu)及其與DNA相互作用的光譜學(xué)研究[J]. 南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，42(4)：103-110.

(編輯：武英耀)

收稿日期：2016-03-31 修回日期：2016-05-23

作者簡(jiǎn)介：張永坡(1983-)，男(漢)，河北石家莊人，講師，博士，研究方向：有機(jī)合成及生物無(wú)機(jī)化學(xué) *通訊作者：趙晉忠，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：0354-6287122；E-mail：zhaojinzhongnd@163.com

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)金(2013YJ41)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014005)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(13-017，2015085)

中圖分類(lèi)號(hào)：O614.24+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)08-0599-05

Synthesis,structure,DNAcleavageactivityofzinc(II)complexeswithquinolinederivativedligand

ZhangYongpo,LvJiayuan,YangJiajia,BaiXue,WangYufeng,GaoYe,ZhaoJinzhong*

(College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective]In order to further explore the DNA cleavage of new and efficient nucleic acid fracture reagent. [Methods]a new mononuclear Zinc(II) complex [ZnL(H2O)3]·H2O of quinoline derivatived ligand (L=sodium 8-(carboxylatomethoxy)quinoline-2-carboxylate has been synthesized). The conpler was characterized using element analyses and infrared spectroscopy. The structure of the complex has been determined by X-ray diffraction crystallographic method. [Results]The Zn(II) center was heptacoordinated with O6N donor sets and the geometry around metal center can be best described as distorted pentagonal bipyramidal. The nuclease activity of the complex has been investigated by gel electrophoresis, and the result showed that complex exhibited a certain chemical nuclease activity. [Conclusion] This study would be beneficial to design efficient and simple structural chemical nuclease.

Key words:Quinoline derivatived ligand; Zinc(II) complex; Crystal structure; DNA cleavage