李璐，趙靜，梁倩，孔存翠，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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紫蘇PfPDAT基因單核苷酸多態(tài)性分析

李璐，趙靜，梁倩，孔存翠，王計(jì)平*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的] 磷脂：二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步?；磻?yīng)的關(guān)鍵酶之一，研究紫蘇PfPDAT基因單核苷酸多態(tài)性，旨在分析該基因多態(tài)性與紫蘇種子油脂含量之間的關(guān)系。[方法] 以脂肪酸含量不同的7個(gè)紫蘇品種為試材，通過(guò)直接測(cè)序法分析PfPDAT基因cDNA全長(zhǎng)序列的單核苷酸多態(tài)性及其與油脂含量的關(guān)系。[結(jié)果]在所測(cè)總長(zhǎng)度為14 679 bp的核苷酸序列中，共檢測(cè)到9個(gè)SNP 和2個(gè)InDel，單核苷酸多態(tài)性頻率分別為1/1 631 bp和1/7 340 bp，其中編碼區(qū)含2個(gè)SNP，非編碼區(qū)為7個(gè)。編碼區(qū)和非編碼區(qū)發(fā)生SNP的頻率分別為1/5 439 bp和1/543 bp。根據(jù)PfPDAT 基因序列多態(tài)性將供試紫蘇材料分為不同的單倍型，單倍型H1和H2中都包含有油脂含量較高和含量較低的材料。[結(jié)論]PfPDAT基因的單倍型分類與紫蘇油脂含量之間沒(méi)有顯著相關(guān)性，同時(shí)也反映了植物種子油脂合成的復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞：紫蘇； 種子油脂； PfPDAT； 單核苷酸多態(tài)性

紫蘇(Perilla frutescens)作為一種藥食同用的新型油料作物，越來(lái)越引起人們的關(guān)注[1]。紫蘇籽油富含α-亞麻酸，是人體必需脂肪酸，但是不能直接在人體內(nèi)合成，只能通過(guò)食物供給[2]，因此，開(kāi)發(fā)基于植物源的α-亞麻酸營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品具有十分重要的意義。目前，有關(guān)紫蘇α-亞麻酸生物合成積累及調(diào)控機(jī)制的研究很少。磷脂：二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步?；磻?yīng)的關(guān)鍵酶之一，PDAT途徑最初是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的，Oelkers等[3]發(fā)現(xiàn)PDAT在酵母中參與對(duì)數(shù)期TAG的合成。該途徑利用磷脂作為脂?；w，二酰甘油(DAG)作為脂?；荏w，在該酶的催化作用下，將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)的sn-2位的酞基鏈轉(zhuǎn)移到DAG上，形成溶血卵磷脂和三酰甘油TAG[4～6]。Dahlqvist等[7]利用蓖麻微粒體制備物可以將2-[14C]蓖麻油酰-DAG作為底物形成TAG，證明在發(fā)育的蓖麻微粒體制備物中具有PDAT活性，對(duì)蓖麻油酸具有高特異性。PDAT被認(rèn)為與特殊FA(fattyacid,FA，主要以脂酰-CoA的方式存在)在TAG中的積累有關(guān)。蓖麻是一種特殊FA植物，在種子中可積累80 %～90 % 的羥基化FA-蓖麻油酸。在蓖麻種子發(fā)育過(guò)程中可檢測(cè)到較高的蓖麻油酸的PDAT酶活性，在轉(zhuǎn)化蓖麻油酸合成基因RcFAH12的擬南芥中過(guò)表達(dá)RcPDAT可使得種子積累的蓖麻油酸由17 %提高到25%[8]。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性，分布在基因編碼區(qū)的SNP又稱為cSNP位于外顯子內(nèi)，cSNP可引起表達(dá)蛋白的多態(tài)性，非同義替換將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的改變[9]。本試驗(yàn)以種子油脂含量不同的紫蘇品種為試驗(yàn)材料，利用直接測(cè)序法研究紫蘇PfPDAT基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，分析PfPDAT基因多態(tài)性與紫蘇種子油脂含量及α-亞麻酸含量之間的關(guān)系，為紫蘇種子油脂品質(zhì)的遺傳改良提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究以晉蘇1號(hào)、中北、白蘇、Y-2、Y-4、Y-7、Y-早為試材， 具體情況如表1。

表1　試驗(yàn)材料

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1紫蘇RNA的提取及cDNA的合成

利用TRNzol總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取7個(gè)紫蘇品種開(kāi)花后10d的種子RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

利用PrimerPremier5.0軟件對(duì)克隆得到的紫蘇PfPDAT全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)能夠進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增的疊套引物，分別命名為：F1/R1和F2/R2(見(jiàn)表2)。

表2　引物序列

1.2.3PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系：模板cDNA2μL，引物1μL，10×TaqBuffer2μL，dNTPMixture(2.5mol·L-1) 1.6μL，DNAPolymerase0.5μL，ddH2O12.9μL，共20μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3min→(94 ℃ 30s→60 ℃ 30s→30 ℃ 2min)×循環(huán)30次→72 ℃ 5min→4 ℃保存 。

將能夠擴(kuò)增出特異性強(qiáng)的單一條帶的PCR產(chǎn)物送至北京金諾銳杰基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，每份材料至少檢測(cè)6個(gè)克隆。

1.2.4SNP位點(diǎn)鑒定

利用Chromas1.81 軟件將測(cè)序峰圖較好的序列用于cSNP分析。當(dāng)|低峰值|/|主峰值|≥0.3 時(shí)，認(rèn)為是雜合位點(diǎn)，反之則為模糊位點(diǎn)，無(wú)法進(jìn)行判斷。

1.2.5SNP位點(diǎn)檢測(cè)

測(cè)序結(jié)果利用DNAStarSeqMan軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和組裝拼接，用DNAStarMegalign軟件對(duì)不同材料的序列進(jìn)行多序列聯(lián)配(ClustalW)，用DnaSP5.0 和PHYLIP軟件包對(duì)不同品種的序列進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性及單倍型分析。

2結(jié)果與分析

2.1紫蘇PfPDAT基因PCR擴(kuò)增

如圖1-1A和1-1B，7個(gè)品種所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物與預(yù)期的分子量相一致，引物特異性較強(qiáng)，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，濃度高，能夠滿足PCR產(chǎn)物測(cè)序，隨后標(biāo)記樣品進(jìn)行雙向測(cè)序。

圖1-1A　F1/R1引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.1-1A　Electrophoresis of amplified PCR product of F1/R1 primer

圖1-1B　F2/R2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.1-1B　Electrophoresis of amplified PCR product of F2/R2 primer　　注： M：DL2000 marker；1～7分別為紫蘇品種晉蘇1號(hào)、白蘇、中北、Y-2、Y-4、Y-7、Y-早。Note: M:DL2000 marker; 1～7 respectively perilla varieties Jin Su 1, Bai Su, Zhong Bei, Y-2, Y-4, Y-7, Y-Zao.

2.2SNP位點(diǎn)鑒定

圖2　PfPDAT基因多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序圖Fig.2　The sequencing map for polymorphism locus of PfPDAT

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在總長(zhǎng)度14 679bp核苷酸序列中共有9個(gè)SNP位點(diǎn)和2個(gè)InDel，SNP位點(diǎn)檢測(cè)如圖2所示，位點(diǎn)清晰且為單一峰，具有較高的可信度。以晉蘇1號(hào)作為參照，9個(gè)SNP位點(diǎn)中有2個(gè)位點(diǎn)位于編碼區(qū)，分別為Y-2的707bp位點(diǎn)處堿基C轉(zhuǎn)換為A，中北722bp位點(diǎn)處堿基T轉(zhuǎn)換為C。剩余的7個(gè)位點(diǎn)和2個(gè)InDel都位于非編碼區(qū)，中北1 627bp位點(diǎn)處堿基C轉(zhuǎn)換為A；Y-4 1 631bp位點(diǎn)處堿基G轉(zhuǎn)換為A；白蘇1 710bp位點(diǎn)處堿基T轉(zhuǎn)換為C；白蘇/中北/Y-7的1 733bp同一位點(diǎn)處發(fā)生突變(中北、Y-7基因多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序圖同白蘇1 733bp故略圖)，均由C轉(zhuǎn)換為T(mén)；Y-早1 869bp位點(diǎn)處堿基G轉(zhuǎn)換為A。

2.3紫蘇PfPDAT基因的單核苷酸多態(tài)性分析

2.3.1紫蘇PfPDAT基因序列多態(tài)性分析

對(duì)7份材料進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果如表3所示：總長(zhǎng)度為14 679bp核苷酸序列中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn)和2個(gè)InDel，多態(tài)性頻率分別為1/1 631bp和1/7 340bp，其中編碼區(qū)有2個(gè)SNP位點(diǎn)，非編碼區(qū)有7個(gè)，SNP在編碼區(qū)和非編碼區(qū)中出現(xiàn)的頻率分別為1/5 439bp和1/543bp，SNP在非編碼區(qū)的變異頻率約為編碼區(qū)的10倍，且9個(gè)SNP都屬于堿基轉(zhuǎn)換突變。2個(gè)InDel出現(xiàn)在非編碼區(qū)，發(fā)生頻率為1/1 901bp，分別在野生型品種Y-2和栽培型品種中北中檢測(cè)到。

表3　PfPDAT基因序列核苷酸變異

核苷酸多樣性(π)的大小代表該基因的遺傳變異程度。PfPDAT基因在序列總長(zhǎng)中π值為0.00127，其中編碼區(qū)為0.000 37，非編碼區(qū)為0.003 16，非編碼區(qū)π值大于編碼區(qū)，因此非編碼區(qū)的遺傳變異程度較大。

2.3.2紫蘇PfPDAT基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)分析

對(duì)7份供試材料PfPDAT基因編碼區(qū)堿基序列和所翻譯的氨基酸序列進(jìn)行檢測(cè)分析，在Y-2和中北2個(gè)品種中各發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP位點(diǎn)，其中中北722bp位點(diǎn)為同義突變，同義變異對(duì)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成沒(méi)有變化，因此對(duì)基因的功能和表型沒(méi)有影響。

位于Y-2第707bp位點(diǎn)的變異為非同義突變，堿基由C轉(zhuǎn)換為A，氨基酸由組氨酸變?yōu)楣劝滨０罚捎谕蛔兾稽c(diǎn)不在該基因PLN02733superfamily功能域之內(nèi)，因此可能不會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成和基因的表達(dá)。

2.3.3紫蘇PfPDAT基因編碼區(qū)多態(tài)性分析

對(duì)7份供試材料PfPDAT基因編碼區(qū)內(nèi)由核苷酸多樣性引起的同義與非同義突變進(jìn)行分析，結(jié)果表明(見(jiàn)表4)：同義突變大于非同義突變。Ka(非同義突變平均數(shù))與Ks(同義突變平均數(shù))之比表示基因的選擇效應(yīng)及選擇方向，當(dāng)Ka/Ks>1時(shí)，基因進(jìn)行正向選擇，快速進(jìn)化基因；Ka/Ks=1時(shí)，為中性變異，群體不發(fā)生改變；Ka/Ks<1時(shí)，進(jìn)行負(fù)向選擇影響，為相對(duì)保守基因[10]。PfPDAT基因Ka與Ks之比為0.3，該基因?qū)儆谪?fù)向選擇，核苷酸序列相對(duì)保守。

表4　PfPDAT編碼區(qū)單核苷酸多樣性

2.4紫蘇PfPDAT基因單倍型分析

對(duì)7份供試材料進(jìn)行聚類分析和單倍型分析，結(jié)果如圖3所示。該基因序列在不同品種間差異較小，4份野生型品種為一分支，剩余3份栽培型品種為另一分支，遺傳關(guān)系較近，遺傳系數(shù)達(dá)0.99。單倍型分析顯示，7份材料可分為2個(gè)單倍型，單倍型H1包含Y-2、Y-4、Y-7、Y-早共4個(gè)野生型品種，其中品種Y-2總脂肪酸含量較高，但品種Y-4、Y-7、Y-早總脂肪酸含量較低；單倍型H2包括晉蘇1號(hào)、白蘇和中北3個(gè)栽培型品種，其中晉蘇1號(hào)總脂肪酸含量較高，白蘇和中北總脂肪酸含量較低。本研究供試材料較少，因此不能很好地解釋油脂含量與單倍型分類之間的相關(guān)性，同時(shí)也表明植物種子油脂合成的復(fù)雜性。

圖3　7份紫蘇材料的聚類分析Fig.3　Cluster analysis of 7 Perilla frutescens genotypes　　注：不同品種紫蘇名稱分別為：BS：白蘇；ZB：中北；JS1：晉蘇1號(hào)；Y-2：Y-2；Y-7：Y-7；Y-4：Y-4；Y-Z：Y-早Note: Different varieties of Perilla frutescens names: BS:BaiSu; ZB:ZhongBei; JS1:JinSu 1; Y-2:Y-2; Y-7:Y-7; Y-4:Y-4; Y-Z:Y-Zao

3結(jié)論與討論

在生物進(jìn)化過(guò)程中，SNP的出現(xiàn)是自然和人工共同選擇的結(jié)果[11～14]，當(dāng)個(gè)體中的SNP隨著時(shí)間的延長(zhǎng)得以保留時(shí)，SNP的發(fā)生會(huì)在一定程度上加快個(gè)體的進(jìn)化速度[15]。作為繼RFLP、AFLP、SSR之后第四代分子標(biāo)記的SNP具有很大的發(fā)展?jié)摿?，廣泛應(yīng)用于生物、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域，在分子育種和遺傳學(xué)等方面發(fā)揮著巨大的作用，大量研究表明SNP與遺傳表型具有直接聯(lián)系，李密杰等[16]研究表明SNP標(biāo)記將成為研究人類及動(dòng)植物遺傳變異和進(jìn)化的重要方法。本研究通過(guò)對(duì)7份供試紫蘇材料PfPDAT基因全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，在總長(zhǎng)度為14 679bp核苷酸序列中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn)和2個(gè)InDel，二者多態(tài)性頻率分別為1/1 631bp和1/7 340bp，均低于棉花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子0.94/100bp[17]、葡萄MYBA轉(zhuǎn)錄因子1/33bp[18]、向日葵基因組編碼區(qū)1/63bp[19]、及水稻基因組編碼區(qū)3/1 000bp[20]的發(fā)生頻率，因此推測(cè)cSNP的發(fā)生頻率可能與生物種類、基因功能和表達(dá)等有一定的相關(guān)性。對(duì)該基因進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)和氨基酸多態(tài)性分析結(jié)果表明：在材料Y-2的第707位點(diǎn)上的SNP變異導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化，但由于這一位點(diǎn)不在氨基酸序列第2～143位的PLN02733superfamily功能域之內(nèi)，因此可能不會(huì)對(duì)紫蘇種子油α-亞麻酸含量及蛋白質(zhì)的合成和表達(dá)產(chǎn)生影響。

植物種子積累儲(chǔ)存TAG是一個(gè)非常復(fù)雜的生理生化過(guò)程，研究表明，PDAT基因表達(dá)與植物種子油含量和油脂成分都有一定的限制作用[21]。前期研究結(jié)果表明本文所用的7個(gè)紫蘇品種在種子發(fā)育的過(guò)程中脂肪酸的組成成分及含量均具有明顯的差異[22]，但在對(duì)PfPDAT基因進(jìn)行單倍型分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：7個(gè)供試材料可以分為兩個(gè)單倍型，單倍型H1和H2中均包含總脂肪酸含量較高和總脂肪酸含量較低的品種，由于本研究所選紫蘇材料較少，因此不能很好地解釋PfPDAT基因單倍型分類與油脂含量之間的相關(guān)性，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明了植物中油脂合成的復(fù)雜性。

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(編輯：武英耀)

收稿日期：2016-03-22 修回日期：2016-04-23

作者簡(jiǎn)介：李璐(1992-)，女(漢)，山西靈石人，在讀碩士，研究方向：紫蘇油脂代謝機(jī)理 *通訊作者：王計(jì)平，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel: 13633544366；E-mail:sxndwjp@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31201266)

中圖分類號(hào)：S565.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)08-0551-06

SinglenucleotidepolymorphismsanalysisofPfPDATGeneinPerilla frutescens

LiLu,ZhaoJing,LiangQian,KongCuncui,WangJiping*

(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective] Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT) is one of the key enzymes that can catalyze the final acylation of triacylglycerol (TAG). The objective of the present study was to detect single nucleotide polymorphisms (SNP) of PfPDAT and determine the relationship between SNP and seed fatty acid content. [Methods] Seven perilla varieties with different fatty acid content were used as the plant materials. The single nucleotide polymorphism of the full-length cDNA sequence of PfPDAT gene was analyzed by sequencing. [Results] Eleven nucleotide mutations were identified, including 9 SNP and 2 InDel in a total of 14679 bp nucleotide acid sequence. The frequencies of SNP and InDel were 1/1 631 and 1 /543, respectively. Among them, 2 SNP loci were in the coding region and 7 SNP in non-coding region. The SNP frequencies were 1/5439 bp and 1/543 bp respectively. The tested seven accessions could be classified as two haplotypes. Haplotype H1 and H2 comprised higher oil content materials and low oil content materials, synchronously. [Conclusion] The results of research showed that there was no significant correlation between haplotype classification of PfPDAT gene and perilla seed oil content, meanwhile it also showed that plant seed oil synthesis was very complicated.

Key words:Perilla frutescens; Seed oil; PfPDAT; Single nucleotide polymorphisms