于姍姍　李敏　張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濟(jì)南 250000）

◆醫(yī)藥快訊◆

一測多評法測定銀杏葉中3種黃酮類成分的含量

于姍姍李敏張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濟(jì)南 250000）

目的：建立測定銀杏葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮類成分的一測多評法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），以槲皮素為內(nèi)參物，建立與山柰素和異鼠李素的相對校正因子，計(jì)算對應(yīng)的含量，同時采用外標(biāo)法測定銀杏葉中這3個指標(biāo)成分的含量，比較計(jì)算值與實(shí)測值的差異，以驗(yàn)證一測多評法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果：一測多評法的計(jì)算值和外標(biāo)法測定值間無顯著差異，實(shí)驗(yàn)所得的校正因子可信。結(jié)論：一測多評法在銀杏葉藥材中3種黃酮類成分的含量測定中具有適用性和可行性。

銀杏葉；一測多評；高效液相色譜；相對校正因子

銀杏又名公孫樹，是最古老的植物之一，有裸子植物活化石之稱。據(jù)《本草綱目》記載，銀杏果具有斂肺平喘，止遺尿、白帶的作用。自從20世紀(jì)60年代開始，很多學(xué)者專家對銀杏葉做了大量的研究工作，其中涉及銀杏葉中含有的化學(xué)成分、銀杏葉的藥理作用和銀杏葉的臨床應(yīng)用，研究表明銀杏葉中的某些成分對心腦血管疾病等有確切的療效，因此銀杏葉在藥品和保健食品的生產(chǎn)上有廣泛的應(yīng)用前景，有的甚至被加工成飲品代茶飲，更擴(kuò)大了應(yīng)用。銀杏葉化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮類、萜類內(nèi)酯類和酚酸類化合物等［1］，《中國藥典》2010年版一部銀杏葉項(xiàng)下以槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮成分作為指標(biāo)成分，通過高效液相色譜法（HPLC）測定上述 3種黃酮成分的含量，以控制銀杏葉的質(zhì)量。本文將一測多評法運(yùn)用到銀杏葉多種黃酮成分的含量測定中，通過運(yùn)用槲皮素對照品檢測其中一種成分含量，達(dá)到對多種成分的考察，以全面控制銀杏葉質(zhì)量。

1儀器與試藥

島津 LC-20AHPLC系統(tǒng)（S），Agilent 1200系列高效液相色譜系統(tǒng)（A）；色譜柱SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm，2012411）（S），Agilent Zorbax SB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm，880975-902）（A），Kromasil 100-5C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm，E84121）（K），Agilent Eclipse Plus C18（50 mm ×4.6 mm，1.8 μm，959941-902）（E）；槲皮素對照品（批號：100081-200406，購自中國食品藥品檢定研究院）、山柰素對照品（批號：110861-200808，購自中國食品藥品檢定研究院）、異鼠李素對照品（批號：110860-200608，購自中國食品藥品檢定研究院）；色譜純：甲醇、磷酸、純凈水，分析純：甲醇、鹽酸、三氯甲烷等。8批銀杏葉樣品分別購自漱玉平民大藥房、東方大藥店、山東博康中藥飲片有限公司、老百姓大藥房、開心大藥店、神農(nóng)大藥房、三九大藥店、建聯(lián)中藥店，經(jīng)鑒定，均為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba）L.的干燥葉。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用SHIMADZU VP-ODS分析柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；甲醇-0.4%磷酸溶液 （50∶50）為流動相，體積流量1.0 mL/min；檢測波長為360 nm；柱溫為36℃。在該色譜條件下，各待測成分分離度良好。色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素對照品、山柰素對照品、異鼠李素對照品適量，加甲醇制成每l mL分別含槲皮素59.343 3 μg，山柰素57.166 0 μg，異鼠李素42.510 0 μg的混合溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備

取銀杏葉中粉約l g，精密稱定，置索氏提取器中，依據(jù)《中國藥典》2010年版銀杏葉總黃酮醇苷含量測定項(xiàng)下處理，加三氯甲烷加熱回流提取2 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干，加甲醇加熱回流提取4 h，提取液蒸干，殘?jiān)蛹状?25%鹽酸溶液（4∶1）混合溶液25 mL，加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4線性關(guān)系考察

圖1對照品和銀杏葉樣品的HPLC圖

取對照品溶液，分別稀釋不同倍數(shù)，配制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積對各對照品的進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。表明各對照品的進(jìn)樣量與峰面積之間均呈良好線性關(guān)系。

表1　線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5精密度試驗(yàn)

取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次 10 μL，計(jì)算得槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD依次為0.42%，0.43%，0.59%。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取購買于山東博康中藥飲片有限公司的銀杏葉依法制備的供試品溶液，分別于室溫放置0，4，8，12，16，20，24 h進(jìn)樣，計(jì)算得槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的 RSD依次為1.2%，1.1%，1.3%。表明制備好的供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取購買于山東博康中藥飲片有限公司的銀杏葉6份，每份約1 g，精密稱定，制備供試品溶液，依法測定，外標(biāo)法計(jì)算得槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的RSD依次為0.9%，1.1%，1.4%。

2.8加樣回收試驗(yàn)

取購買于山東博康中藥飲片有限公司的銀杏葉6份，每份約0.5 g，精密稱定，按各成分在藥材中的含量不同分別加入適量的對照品，依照“2.3”制備供試品溶液，依法測定，分別計(jì)算各對照品的加樣回收率。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率依次為99.5%，98.2%，96.6%，回收率之間的RSD依次為1.2%，0.8%，1.4%。

2.9不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

取“2.4”項(xiàng)下配制的系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，各進(jìn)樣10 μL，以槲皮素為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算槲皮素對山柰素、異鼠李素的相對校正因子［2］，取平均值。結(jié)果見表2。

表2　不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

2.10色譜峰定位參數(shù)的考察

為了在僅采用槲皮素為對照品時，能夠確認(rèn)山柰素和異鼠李素色譜峰的位置，從而通過獲得的相對校正因子同時計(jì)算3種成分的量，達(dá)到一測多評的目的，考察了采用不同儀器和色譜柱時山柰素、異鼠李素色譜峰與槲皮素色譜峰間的相對保留時間之比。結(jié)果見表3。結(jié)果表明其他待測成分與槲皮素相對保留時間之比的RSD在1.36%～1.67%，可見，與槲皮素色譜峰的相對保留時間之比可作為其他2個待測成分（異鼠李素和山柰素）色譜峰的定位參數(shù)。

表3　相對保留時間考察結(jié)果

2.11樣品測定

取8批銀杏葉制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算銀杏葉中的槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，結(jié)果見表4。表明兩種方法所得結(jié)果無顯著差異。

表4　樣品測定結(jié)果（mg/g）

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC外標(biāo)法測定并計(jì)算了銀杏葉中的槲皮素與山柰素、異鼠李素之間的相對校正因子，用相對校正因子計(jì)算得到了山柰素、異鼠李素的含量，實(shí)現(xiàn)了一測多評。同時，采用外標(biāo)法測定了銀杏葉中的山柰素、異鼠李素的含量，比較了采用外標(biāo)法測得數(shù)值與采用相對校正因子計(jì)算所得數(shù)值之間的差異。結(jié)果表明山柰素與異鼠李素采用相對校正因子計(jì)算的含量與采用外標(biāo)法測定值之間無顯著差異。一測多評法在銀杏葉的3種黃酮類成分的定量測定中的適用性和可行性得到了驗(yàn)證。

［1］ Van Beek TA，Montoro P.Chemical analysis and quality control of ginkgo biloba leaves［J］.J chromatogr A，2009，1216（11）：2002-2032.

［2］王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

Determination of Three Flavonoids Ingredients in Ginkgo with Multi-components by Single-marker

Yu Shanshan，Li Min，Zhang Qiuhong（Jinan Experimental Center for Drug and Food，Shandong Jinan 250000，China）

Objective：A quantitive analysis method of multi-components by single marker（QAMS）was established for the determination of quercetin，kaempferide and isorhamnetin in ginkgo.Methods：Using the HPLC method，with the typical composition quercetin as the indexes，the relative correction factors（RCF）between quercetin kaempferide and isorhamnetin were established to detect the quantitation of quercetin and calculate the corresponding contents.At the same time the external standard method was used for quantitating the three constituents，and compared the difference between calculated values and estimated values，to ensure the accuracy and feasibility of the method apply to ginkgo.Results：Calculated values and estimated values did not make significant difference on QAMS and external standard method.And it showed that the RCF was authentic.Conclusion：QAMS has the applicability and feasibility in the determination of three flavonoids ingredients in Ginkgo.

Ginkgo；QAMS；HPLC；RCF

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.03.008

于姍姍，女，碩士。主要從事中藥質(zhì)量控制與研究。E-mail：yssyb@126.com李敏，女，碩士。主要從事中藥質(zhì)量控制與研究。通訊作者E-mail：568027183@qq.com

2015-12-25）