楊曉航，牛文民，王　　淵，劉思洋，朱先偉，王　　強(qiáng)，王衛(wèi)剛，劉智斌（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng)　7046；.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安　700；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng)　7000）

電針迎香穴對(duì)大鼠嗅覺(jué)功能和嗅黏膜成纖維生長(zhǎng)因子的干預(yù)效應(yīng)研究

楊曉航1，牛文民1，王淵1，劉思洋2，朱先偉1，王強(qiáng)1，王衛(wèi)剛3，劉智斌1
（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng)712046；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng)712000）

［目的］探討電針迎香穴對(duì)大鼠嗅覺(jué)功能和嗅黏膜成纖維生長(zhǎng)因子（FGFs）的干預(yù)效應(yīng)和作用通路。［方法］將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、嗅覺(jué)功能障礙組、嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺(jué)功能障礙+針刺組、嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組5組，每組10只。采用Triton X-100鼻腔注射法復(fù)制大鼠嗅覺(jué)功能障礙動(dòng)物模型和大鼠嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷動(dòng)物模型。通過(guò)電針迎香穴干預(yù)后，分析各組大鼠埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)、嗅覺(jué)迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果及ELISA法檢測(cè)的FGFs含量。［結(jié)果］埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)及嗅覺(jué)迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針迎香穴可以顯著縮短嗅覺(jué)功能障礙模型大鼠尋找食物小球的時(shí)間（P＜0.01），并且電針迎香穴干預(yù)后模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量明顯升高（P＜0.01）。［結(jié)論］電針迎香穴可顯著提高嗅覺(jué)功能障礙模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量，其作用與三叉神經(jīng)通路的完整性有關(guān)。

電針；迎香穴；嗅覺(jué)功能障礙；成纖維生長(zhǎng)因子

嗅覺(jué)在人類的行為、情感等各種生理及心理狀態(tài)中均發(fā)揮著重要作用。嗅覺(jué)功能障礙可直接導(dǎo)致患者認(rèn)知障礙、生存質(zhì)量下降，例如由于嗅覺(jué)功能障礙直接導(dǎo)致味覺(jué)異常，進(jìn)而引起營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和體質(zhì)衰退等。臨床中嗅覺(jué)功能障礙自報(bào)患病率為15.3%，實(shí)際患病率可能更高［1-4］。針刺迎香穴廣泛應(yīng)用于臨床治療嗅覺(jué)功能障礙［5-8］。迎香穴最早見(jiàn)于《針灸甲乙經(jīng)》，另名沖陽(yáng)，屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)，手、足陽(yáng)明之會(huì)，位于鼻翼外緣中點(diǎn)旁，當(dāng)鼻唇溝中；主治鼻塞、鼻衄、鼻淵、鼻息肉、口眼斜、面癢浮腫及膽道蛔蟲(chóng)癥等?！夺樈?jīng)指南》云“鼻室無(wú)聞，迎香可引”；《扁鵲神應(yīng)針灸玉龍經(jīng)》云“不聞香臭從何治，須向迎香穴內(nèi)攻”，其中所謂“不聞香臭”即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的嗅覺(jué)功能障礙（包括嗅覺(jué)減退和喪失）。在本研究中，筆者以嗅覺(jué)功能障礙模型Sprague-Dawley（SD）大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)電針迎香穴干預(yù)前及干預(yù)2周后5組大鼠間嗅覺(jué)行為學(xué)、成纖維生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）含量等指標(biāo)進(jìn)行比較，為闡明電針迎香穴治療嗅覺(jué)功能障礙的效應(yīng)和作用通路提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，約250 g，雄性。置于可控的SPF級(jí)環(huán)境條件下，室溫保持在21±3°C，光/暗周期為13/11 h，燈光于早晨6時(shí)切換，自由飲水采食。所有的實(shí)驗(yàn)均獲得陜西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守陜西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法。

1.2器材和試劑Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（北京現(xiàn)代太極電子有限公司）；Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。Rat glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）ELISA KIT（武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司）。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、嗅覺(jué)功能障礙組、嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺(jué)功能障礙+針刺組、嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組等5組，每組10只。

1.3.2嗅覺(jué)障礙模型制作參照秦照萍等［9］和Cummings的方法［10］，將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，用微量注射器（注射器針頭磨鈍）對(duì)雙側(cè)鼻孔一次性灌注100μl0.7%Triton X-100（PBS配制），灌流時(shí)間為1min。

1.3.3眶下神經(jīng)切斷模型常規(guī)消毒大鼠兩側(cè)眶下皮膚區(qū)域，沿兩側(cè)眶下緣做一水平切口，長(zhǎng)約0.5 cm，鈍性分離皮下脂肪，暴露眶下孔，仔細(xì)分離眶下神經(jīng)及其同名動(dòng)靜脈，避開(kāi)血管，切斷眶下神經(jīng)。

1.3.4電針?lè)椒ㄓ阊ǘㄎ唬捍笫蟊强淄鈧?cè)上端，有毛與無(wú)毛交界處。電針?lè)椒ǎ河阊ㄏ騼?nèi)上方斜刺0.3 cm，電針參數(shù)：1 mA，疏密波；正極和負(fù)極各接一側(cè)迎香穴，刺激時(shí)間10 m in，1次/日。以上電針處理均在造模成功后第1天進(jìn)行。5天為1個(gè)療程，療程間休息2天，共進(jìn)行2個(gè)療程。未行電針治療組常規(guī)飼養(yǎng)至電針療程結(jié)束［11-12］。

1.3.5埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)采用大小一致的新鮮鼠料（0.5 g），以減少外源性食物味道的干擾。測(cè)試前3 d限制大鼠進(jìn)食，每只給予鼠料0.2 g/d，自由飲水；同時(shí)這3 d內(nèi)將單只大鼠分別置入測(cè)試時(shí)采用的鼠籠（45 cm×24 cm×20 cm）中熟悉10min。測(cè)試前將0.5 g的食物小球埋藏在鼠料表面以下5 cm處并隨機(jī)更換置放食物小球的位置，記錄大鼠進(jìn)入鼠籠內(nèi)開(kāi)始到大鼠用前爪抓住食物小球并啃噬的時(shí)間，等大鼠吃完食物后再將其放回籠中。休息4 h后，將食物小球隨機(jī)置放在鼠料表面不同位置，重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)以300 s（5次測(cè)試的平均值）內(nèi)未找到食物小球的大鼠即定為嗅覺(jué)喪失。

1.3.6嗅覺(jué)迷宮實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［13-14］方法改良自制圓形迷宮，其中等分為6個(gè)小格，將測(cè)試用的新鮮鼠料（0.5 g）隨機(jī)放置在大鼠不能直接看見(jiàn)的小格后面而僅靠其嗅覺(jué)才能找到。實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠首先被放置在迷宮的中間，記錄大鼠進(jìn)入迷宮內(nèi)到用前爪抓住食物小球并啃噬的時(shí)間。等大鼠吃完食物后再將其放回籠中，并取出食物殘?jiān)痛笫蟮呐判刮铮?0%的乙醇和水清潔迷宮防止對(duì)后面測(cè)試的干擾。陽(yáng)性對(duì)照是將食物小球放置于小格之外，大鼠能夠直接看見(jiàn)的部位。所有實(shí)驗(yàn)以300 s（5次測(cè)試的平均值）內(nèi)未找到食物小球的大鼠即定為嗅覺(jué)喪失。

1.3.7酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)2個(gè)療程結(jié)束后，常規(guī)碘伏消毒局部皮膚，2%戊巴比妥鈉深度麻醉（100 mg/kg）后，取口腔入路斷頸去額部皮膚、肌肉及下頜骨后，將頭顱取下。用血管鉗將一側(cè)鼻腔完全打開(kāi)，于鼻腔后上的顱底部，可見(jiàn)鼻中隔最后上部的嗅區(qū)呈黃色，與呼吸道黏膜有較明顯的區(qū)別。將此嗅區(qū)鼻中隔（嗅黏膜和骨質(zhì)）完整取下，在顯微鏡下將兩側(cè)的嗅黏膜自骨片上完整刮下。將組織切成碎片并用特定比例的PBS勻漿（每10mg組織對(duì)應(yīng)100μl PBS）。將勻漿液用超聲波進(jìn)一步進(jìn)行處理來(lái)破壞細(xì)胞膜。之后，將勻漿液1 500×g離心15 min，取上清并存儲(chǔ)在-80°C超低溫冰箱。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作對(duì)組織中FGFs含量進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組大鼠在埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)、嗅覺(jué)迷宮實(shí)驗(yàn)中尋找食物小球的時(shí)間比較見(jiàn)表1。在兩項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，嗅覺(jué)功能障礙組與嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠尋找食物小球的時(shí)間均超過(guò)300 s，有極顯著性差異（P＜0.01），可以判斷為嗅覺(jué)喪失。嗅覺(jué)功能障礙模型大鼠經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，與嗅覺(jué)功能障礙組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）。嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組大鼠尋找食物小球所用時(shí)間依然均超過(guò)300 s。

表1　　各組大鼠尋找食物小球的時(shí)間比較 （s，±s）

表1　　各組大鼠尋找食物小球的時(shí)間比較 （s，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與嗅覺(jué)功能障礙組比較，②P＜0.01

組　別　n　埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)嗅覺(jué)迷宮實(shí)驗(yàn)正常對(duì)照組　10　38.2±3.4　52.2±4.8嗅覺(jué)功能障礙組　10　?。?00①　　＞300①嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組　10　?。?00①　?。?00①嗅覺(jué)功能障礙+針刺組　10　44.5±5.2②　68.4±4.2②嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組　10　?。?00　?。?00

2.2各組FGFs含量結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組比較，嗅覺(jué)功能障礙組與嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組中大鼠組織中FGFs含量升高，有顯著性差異（P＜0.05）；與嗅覺(jué)功能障礙組比較，針刺迎香穴治療后的嗅覺(jué)功能障礙+針刺組大鼠組織中FGFs含量升高，有極顯著性差異（P＜0.01），而嗅覺(jué)功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組大鼠組織中FGFs含量沒(méi)有顯著性差異。

圖1　　各組FGFs含量相對(duì)濃度比比較

3　討論

本研究中埋藏食物小球和嗅覺(jué)迷宮兩項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，模型組大鼠尋找食物小球時(shí)間超過(guò)300 s，證實(shí)經(jīng)0.7%Triton X-100的PBS溶液鼻腔灌流的SD大鼠可以成功復(fù)制嗅覺(jué)功能障礙模型。單純嗅覺(jué)功能障礙模型大鼠經(jīng)過(guò)電針迎香穴干預(yù)后，與模型組比較尋找食物小球時(shí)間顯著縮短，說(shuō)明電針迎香穴有助于嗅黏膜化學(xué)損傷后嗅覺(jué)功能的恢復(fù)。同時(shí)電針迎香穴在模型大鼠行眶下神經(jīng)切斷術(shù)后，其改善嗅覺(jué)功能障礙的效應(yīng)消失。神經(jīng)解剖學(xué)研究表明：迎香穴位于三叉神經(jīng)上頜支的眶下神經(jīng)分布區(qū)域，因此眶下神經(jīng)是迎香穴的感覺(jué)傳入神經(jīng)。而三叉神經(jīng)的眼支分出鼻睫神經(jīng)分布于鼻腔黏膜，包含嗅上皮區(qū)域，由此形成鼻腔內(nèi)嗅覺(jué)神經(jīng)與三叉神經(jīng)重疊分布模式。大量研究已表明，嗅覺(jué)的產(chǎn)生是嗅覺(jué)神經(jīng)和三叉神經(jīng)兩大系統(tǒng)協(xié)同作用的結(jié)果［15-17］。在中樞和外周的嗅覺(jué)信息的處理中，兩個(gè)系統(tǒng)可以相互影響，三叉神經(jīng)的刺激能反射性地影響心血管反應(yīng)、呼吸速率、鼻腫脹、鼻分泌和噴嚏［18-21］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)可能經(jīng)局部軸突反射合并P物質(zhì)（SP）的釋放參與調(diào)制嗅黏膜上皮嗅受體細(xì)胞的活動(dòng)，從而影響嗅覺(jué)功能，調(diào)節(jié)嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)氣味分子的反應(yīng)［22-23］。因此，可以推測(cè)三叉神經(jīng)-眶下神經(jīng)通路的完整性與電針迎香穴干預(yù)嗅覺(jué)功能障礙的效應(yīng)密切相關(guān)。

嗅感神經(jīng)元（Olfactory Receptorneurons，ORN）是體內(nèi)已明確的唯一具備持續(xù)再生能力的神經(jīng)元［16］。FGFs是調(diào)節(jié)ORN再生的主要細(xì)胞因子，其在嗅黏膜的表達(dá)促進(jìn)ORN前體神經(jīng)元的增殖和分化。本次研究結(jié)果表明，電針迎香穴可顯著提高模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量，且該效應(yīng)同樣依賴于三叉神經(jīng)-眶下神經(jīng)通路的完整性。

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（編輯熊瑜）

R254.9

A

2095-4441（2016）02－0005－03

2016-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81273859）；陜西省教育廳專項(xiàng)科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：11JK0679）

劉智斌，博士，教授，研究方向：針灸推拿治療脊柱疾病和老年病的基礎(chǔ)與臨床研究