李曉青，荊月婷，馮全福，楊愛國，劉　旦，程立銳，陳　果，耿銳梅，任　民，王紹美*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

PEG模擬干旱脅迫對不同烤煙品種生理特性的影響

李曉青1，荊月婷2，馮全福1，楊愛國1，劉旦1，程立銳1，陳果1，耿銳梅1，任民1，王紹美1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

以抗旱性不同的烤煙品種中煙14和中煙100為材料，采用不同濃度的聚乙二醇（PEG-6000）模擬不同程度的干旱脅迫，研究不同干旱脅迫程度下不同品種煙葉內(nèi)丙二醛和脯氨酸含量變化以及對煙葉內(nèi)保護(hù)性酶活性的影響，探究煙草對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理，為煙草的抗旱篩選提供一定依據(jù)。研究結(jié)果表明，隨著脅迫時間的延長，丙二醛呈現(xiàn)增加的趨勢，且相同脅迫時間內(nèi)，PEG濃度15%處理，葉片中丙二醛含量最高；脯氨酸含量隨著脅迫時間的延長不斷增加，在相同脅迫時間內(nèi)，PEG濃度15%處理葉片中脯氨酸含量最高；隨著脅迫時間的延長，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在處理1 d時達(dá)到最大值，PEG濃度15%處理酶活性最高。通過檢測數(shù)據(jù)證實中煙14的抗旱性較強(qiáng)，各項檢測指標(biāo)用于煙草抗旱性研究具有可靠性。

烤煙；PEG脅迫；丙二醛；脯氨酸；保護(hù)性酶

隨著工業(yè)化的發(fā)展，人類活動對環(huán)境的干預(yù)，極端惡劣的天氣時常發(fā)生，氣候環(huán)境變化已成為阻礙農(nóng)作物生產(chǎn)的重要限制因素，頻發(fā)的干旱災(zāi)害對農(nóng)作物生產(chǎn)的影響尤甚[1-2]。干旱脅迫對植物的影響在細(xì)胞水平表現(xiàn)為導(dǎo)致植物膜質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)[3]。丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化作用的中間產(chǎn)物，在一定程度上可以用來作為細(xì)胞膜受傷害程度的標(biāo)志物[4-6]；同時，在干旱脅迫條件下，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等，會通過協(xié)調(diào)作用有效清除?O2-、?OH、H2O2等自由基，防御膜脂過氧化，這成為植物體對抗干旱脅迫生長環(huán)境的重要手段[7-11]。脯氨酸（Pro）作為植物體內(nèi)主要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的水合能力；在受到干旱等逆境脅迫時，脯氨酸可以通過累積而提高細(xì)胞液的濃度，從而降低細(xì)胞原生質(zhì)的滲透勢，保持一定的壓力勢，促使細(xì)胞從外界吸收水分，防止細(xì)胞脫水，以適應(yīng)水分脅迫環(huán)境[12-16]。

煙草作為一種主要的經(jīng)濟(jì)作物，在整個生育期內(nèi)對水分的需求量高，而我國大部分煙區(qū)受地理位置和氣候環(huán)境影響，處于水資源短缺狀態(tài)，導(dǎo)致煙株因受水分脅迫無法正常生長，煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[17-19]。水分脅迫已成為限制我國煙區(qū)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步提高的重要因素[20]。對烤煙抗旱性生理特征開展比較，篩選抗旱性強(qiáng)、可以在生產(chǎn)上推廣的品種的研究結(jié)果已報導(dǎo)若干[21-22]。本研究選擇在生產(chǎn)實踐中已界定為抗旱性強(qiáng)、長勢旺盛的豐產(chǎn)型烤煙品種中煙14[23]，及喜肥水、品質(zhì)、抗性、產(chǎn)量、適應(yīng)性等綜合性狀較能兼顧的烤煙品種中煙100[24-25]作為研究對象，通過PEG-6000模擬干旱脅迫條件，檢測兩個烤煙品種煙葉中MDA、脯氨酸含量和保護(hù)性酶活性的變化規(guī)律，揭示煙草對水分脅迫的生理響應(yīng)規(guī)律，進(jìn)一步驗證這些檢測指標(biāo)在煙草抗旱性研究中應(yīng)用的可靠性。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試品種為栽培烤煙品種中煙14和中煙100，由中國煙草遺傳育種研究（北方）中心提供種子。

1.2試驗設(shè)計

將煙草種子播種于盤中，大十字期假植，長至5～8片真葉成苗，分別取長勢均等的成苗期中煙14和中煙100煙苗各80棵，將根部清洗干凈，并用蒸餾水清洗3次以上，每品種煙苗分成4組，每20棵一組，分別放在裝有PEG-6000溶液濃度為0%（蒸餾水對照）、10%、15%、20%的1000 mL燒杯中，于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d五個時間段取樣。每個處理隨機(jī)取葉片5 g左右，重復(fù)3次，用電子天平（0.0001）稱重并記錄重量，液氮速凍保存于-80℃冰箱中備用。每份樣品分別測定MDA、Pro含量以及SOD、POD、CAT活性。

1.3指標(biāo)測定方法

1.3.1丙二醛含量測定煙葉中MDA含量的測定，采用硫代巴比妥酸法[26-27]。

1.3.2脯氨酸含量測定煙葉中Pro含量的測定，

采用酸性茚三酮法[26]。

1.3.3保護(hù)性酶活性的測定SOD活性的測定采用NBT還原法，以每單位時間內(nèi)光化還原50% NBT為1個酶活性單位[26]；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[26]；CAT活性的測定采用紫外吸收法[26]。

1.3.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用excel 2007作圖，SPSS 8.0軟件進(jìn)行處理方差分析，檢驗數(shù)據(jù)差異顯著性。

2　結(jié)果

2.1PEG-6000脅迫對不同煙草品種丙二醛含量的影響

由圖1、2可知，隨著脅迫時間延長，對照處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中MDA含量逐漸減少，變幅較小，趨于穩(wěn)定；同一PEG濃度處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中MDA含量都不斷增加，但中煙100比中煙14煙苗煙葉中MDA含量變幅較大。

在4個PEG濃度處理中，6 h時，對照處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中的MDA含量最高；而PEG濃度10%處理的煙苗煙葉中MDA含量最低。從6 h到1 d，PEG濃度10%、15%、20%處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉內(nèi)MDA含量增加與處理濃度間具有相關(guān)性。從1 d到2 d，PEG濃度15%處理超過PEG濃度20%處理煙苗煙葉中MDA的含量，曲線產(chǎn)生交叉，交叉點出現(xiàn)的時間中煙14比中煙100早。從2 d到3 d，PEG濃度10%、15%、20%處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中MDA的含量都急劇增加，PEG濃度15%處理的曲線增幅更顯著。

圖1　PEG-6000脅迫對中煙14丙二醛含量的影響Fig.1　Effects of PEG-6000 stress on the content of MDA in Zhongyan14

圖2　PEG-6000脅迫對中煙100丙二醛含量的影響Fig.2　Effects of PEG-6000 stress on the content of MDA in Zhongyan100

2.2PEG-6000脅迫對不同煙草品種脯氨酸含量的影響

由圖3、4可知，隨著脅迫時間延長，對照處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中脯氨酸的含量逐漸增加，但變幅較小，且始終低于其他濃度處理。在不同濃度PEG處理下，中煙14和中煙100煙苗煙葉中脯氨酸的含量具有相似的變化趨勢，含量逐漸升高，但前者比后者積累量相對多，且含量變化相對平穩(wěn)，后者含量變化相對較大。

在4個PEG濃度處理中，從6 h到12 h，PEG濃度15%、20%處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中脯氨酸含量稍有下降，變幅極小，而PEG濃度10%處理的中煙14煙苗煙葉中的脯氨酸含量明顯上升，中煙100煙苗煙葉中的脯氨酸含量稍有下降，但變幅極??；從12 h到1 d，各濃度處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中脯氨酸含量增幅較大；從1 d 到3 d，脯氨酸含量趨于穩(wěn)定。PEG濃度15%處理的中煙14和中煙100煙苗煙葉中脯氨酸含量基本一直處于最高。

圖3　PEG-6000脅迫對中煙14脯氨酸含量的影響Fig.3　Effects of PEG-6000 stress on the content of proline in Zhongyan 14

圖4　PEG-6000脅迫對中煙100脯氨酸含量的影響Fig.4　Effects of PEG-6000 stress on the content of proline in Zhongyan 100

2.3PEG-6000脅迫對不同煙草品種保護(hù)性酶活性的影響

2.3.1PEG-6000脅迫對不同煙草品種SOD活性影響由表1、2可知，隨著脅迫時間延長，不同PEG濃度處理下，中煙14和中煙100煙苗煙葉中SOD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

在4個PEG濃度處理中，中煙14和中煙100煙苗煙葉中SOD的活性：脅迫6 h，對照處理最低，PEG濃度15%處理與對照處理差異最大，分別為對照處理的3.09倍和2.47倍；脅迫12 h，PEG濃度10%、15%、20%處理均與對照處理具有極顯著差異（P<0.01）；脅迫1d時，SOD活性均達(dá)到最大值，且PEG濃度15%處理仍與對照處理間差異最大分別為對照處理的1.28和1.61倍；脅迫從1 d到3 d，各處理的SOD活性持續(xù)降低，先后低于對照處理，PEG濃度15%處理降幅最大，脅迫2 d時，與對照組相比分別降低64.11%和52.04%，差異極顯著（P<0.01）。

表1　PEG-6000脅迫對中煙14 SOD活性影響Table 1　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on SOD activities in Zhongyan 14

表2　PEG-6000脅迫對中煙100 SOD活性影響Table 2　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on SOD activities in Zhongyan 100

2.3.2PEG-6000脅迫對不同煙草品種POD活性影響由表3、4可知，隨著脅迫時間延長，不同PEG濃度處理下，中煙14和中煙100煙苗煙葉中POD活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

在4個PEG濃度處理中，中煙14和中煙100煙苗煙葉中POD的活性：脅迫6 h，PEG濃度10%處理高于對照處理，其他處理低于對照處理；脅迫從6 h到1 d，4個濃度處理的POD活性逐漸升高，到12 h，PEG濃度10%、15%、20%處理已經(jīng)高于對照處理，并與對照處理具有極顯著差異（P<0.01）；脅迫1 d，4個濃度處理的POD活性均達(dá)到最大值，PEG濃度15%處理的POD活性最高，與對照差異最大，分別為對照處理的2.07和2.20倍；脅迫時間從1 d到3 d，4個濃度處理的POD活性逐漸降低，脅迫達(dá)到3 d時，各PEG濃度處理的POD活性均低于對照，PEG濃度15%處理的POD活性最低，分別比對照降低62.04%和49.03%，呈極顯著差異（P<0.01）。

表3　PEG-6000脅迫對中煙14 POD活性影響Table 3　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on POD activities in Zhongyan 14

表4　PEG-6000脅迫對中煙100 POD活性影響Table 4　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on POD activities in Zhongyan 100

2.3.3PEG-6000脅迫對不同煙草品種CAT活性影響由表5、6可知，隨著脅迫時間延長，不同PEG濃度處理下，中煙14和中煙100煙苗煙葉中CAT活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

在4個PEG濃度處理中，中煙14和中煙100煙苗煙葉中CAT的活性變化為：脅迫6 h，PEG濃度15%、20%處理的CAT活性高于對照處理和PEG濃度10%處理，同時PEG濃度15%處理的CAT活性最高，分別相當(dāng)于對照處理的1.98倍和1.71倍；從6 h到1 d，4個濃度處理的CAT活性總體呈上升趨勢，到1 d達(dá)到最高點，此時PEG濃度15%處理的煙葉中CAT活性仍比其他濃度處理高，且與對照處理差異最大，為對照處理的2.68和3.46倍；從1 d到3 d，CAT活性開始逐漸降低，PEG濃度15%處理的CAT活性急劇下降，2 d時已經(jīng)低于其他各處理，并保持最低，至脅迫3 d，PEG濃度15%處理的CAT活性比對照處理降低79.61%和56.38%，差異極顯著（P<0.01）。

3　討論

3.1PEG-6000脅迫對不同煙草品種丙二醛和脯氨酸含量的影響

干旱脅迫使植物體內(nèi)活性氧自由基累積，導(dǎo)致膜脂過氧化作用，其中間產(chǎn)物MDA可作為膜脂過氧化程度的指標(biāo)物[28]。Guy[29]研究指出：在正常情況下，植物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除存在動態(tài)平衡，干旱脅迫造成植物體內(nèi)的氧化脅迫，通過對膜系統(tǒng)的損傷而傷害植物。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著從6 h 到1 d延長，PEG濃度10%、15%、20%處理中煙14和中煙100煙苗葉片中的MDA含量從低于對照處理轉(zhuǎn)為超過并高于對照處理，說明脅迫過程中出現(xiàn)了細(xì)胞膜的膜脂過氧化，細(xì)胞膜受到傷害，MDA產(chǎn)生量逐漸增加。隨著脅迫時間延長，同一PEG濃度處理，中煙14比中煙100煙苗煙葉內(nèi)MDA含量少，且MDA含量變化相對較穩(wěn)定。這表明中煙14的細(xì)胞膜過氧化程度比較小，受傷害的程度較輕，中煙100煙葉內(nèi)MDA迅速積累，其所受傷害比較大，耐干旱脅迫能力較差。這在一定程度上用試驗數(shù)據(jù)證明了生產(chǎn)實踐的結(jié)論，中煙14抗旱性強(qiáng)，中煙100喜肥水。

表5　PEG-6000對中煙14 CAT活性影響Table 5　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on CAT activities in Zhongyan 14

表6　PEG-6000對中煙100 CAT活性影響Table 6　Effects of drought stress simulated by PEG-6000 on CAT activities in Zhongyan 100

在一定程度上，植物體內(nèi)脯氨酸含量可以反映植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種脯氨酸積累較多[30]，脯氨酸含量測定用作抗旱育種的生理指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，PEG濃度10%、15%、20%處理時，中煙14比中煙100煙苗煙葉內(nèi)脯氨酸含量積累多，且前者含量穩(wěn)定上升，后者含量變幅大，同時間和同一PEG濃度處理的煙葉內(nèi)脯氨酸含量低于中煙14，因此中煙100的抗旱性差于中煙14。

當(dāng)PEG濃度15%時，隨脅迫時間延長，MDA和脯氨酸含量持續(xù)上升，超過其他PEG濃度處理，說明PEG濃度15%對煙苗的脅迫更加嚴(yán)重。

3.2PEG-6000脅迫對不同煙草品種保護(hù)性酶活性的影響

有關(guān)研究表明，在受到干旱脅迫時，抗旱性較強(qiáng)品種細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性維持較高水平，但隨時間延長、活性氧自由基的不斷積累以及MDA含量的積累對細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致酶活性下降，但抗旱性品種酶活性下降速度明顯低于不抗旱性品種[31-32]。SOD作為植物體內(nèi)抗氧化的第一道防線[33]，其活性常用作檢測植物抗逆能力的一個指標(biāo)。覃鵬等[34]研究表明，抗旱性較強(qiáng)品系的SOD活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其他品系在處理期間SOD活性一直處于上升趨勢，可能為了適應(yīng)干旱脅迫，更快地清除體內(nèi)活性氧。當(dāng)作物受到干旱脅迫時，POD可以有效的幫助清除植物體內(nèi)積累的H2O2。CAT同POD作用相似，與SOD共同組成細(xì)胞的防御系統(tǒng)[35-36]。

同一PEG濃度脅迫處理下，在同一時間，中煙14比中煙100煙苗煙葉中的SOD、POD、CAT活性都高，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對活性氧的清除閾值（1 d）時，保護(hù)性酶的活性開始降低，中煙14的降低速度低于中煙100，說明中煙100的抗旱性比較差。這與前人對糜子幼苗[37]、甘草[31]、狗牙根[38]、小麥[39]的研究結(jié)果相似。

不同濃度PEG脅迫中煙14和中煙100煙苗時，SOD、POD和CAT活性呈現(xiàn)基本一致的先升高后降低趨勢，與袁有波[40]的研究結(jié)果相似。短時間（1 d）內(nèi)SOD、POD和CAT活性均迅速升高，這有利于消除因干旱脅迫煙苗煙葉中產(chǎn)生的活性氧自由基，共同抵御逆境，降低膜脂過氧化作用，減少膜相對透性；隨著脅迫時間延長，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基的增加，破壞和消除了活性氧清除酶的結(jié)構(gòu)和活性，導(dǎo)致SOD、POD和CAT活性降低，脂質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致膜透性增大，與孫彩霞等[41]的研究結(jié)果相似。當(dāng)PEG濃度15%時，隨脅迫時間的延長，3種保護(hù)性酶都呈現(xiàn)出急劇升高，急劇降低變幅劇烈的現(xiàn)象，說明PEG濃度15%對煙苗的脅迫更加嚴(yán)重，造成保護(hù)防御系統(tǒng)破壞，保護(hù)性酶下降[42]。

4　結(jié)論

本研究通過PEG模擬干旱脅迫測定煙葉中MDA、脯氨酸的含量和保護(hù)性酶活性，比較分析檢測指標(biāo)變化規(guī)律。結(jié)果表明，中煙14的抗性強(qiáng)于中煙100。研究同時揭示了煙草對水分脅迫的生理響應(yīng)規(guī)律，并進(jìn)一步驗證了這些檢測指標(biāo)在煙草抗旱性研究中應(yīng)用的可靠性。

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Effects of Drought Stress Simulated by PEG on Physiological Characteristics in Different Flue-cured Tobacco Cultivars

LI Xiaoqing1,JING Yueting2,FENG Quanfu1,YANGAiguo1,LIU Dan1,CHENG Lirui1, CHEN Guo1,GENG Ruimei1,REN Min1,WANG Shaomei1*
(1.Tobacco Research Institute,ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao,266101 China;2.QingdaoAgriculture University,Qingdao 266109,China)

in order to explore the mechanism of tobacco response to drought stress and to provide a basis for drought resistance screening in tobacco,an experiment was carried out to study the changes of MDA and proline contents and protective enzyme activities in leaves of flue-cured tobacco varieties Zhongyan 100 and Zhongyan under different PEG-6000 concentrations.The results showed that,MDA showed on a trend of increase with the time of stress treatment and at the same treating time,MDA content was the highest under the 15%concentration of PEG.Proline increased with the time of treatment and at the same treating time,proline content was the highest under the 15%concentration of PEG.The activities of superoxide dismutase(SOD),peroxdase(POD)and catalase(CAT)increased firstly and decreased subsequently with stress time,reaching the maximum activities after 1 day,with the highest activities under the 15%concentration of PEG.Zhongyan 14 was confirmed to have higher drought resistance,suggesting that the detection indexes in this study can be used in drought resistance evaluation of tobacco.

flue-cured tobacco;PEG stress;MDA;proline;protective enzymes

S4572.01

1007-5119（2016）03-0015-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.003

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項“干旱脅迫下煙草蛋白質(zhì)組分的差異分析研究”（0032010037）；國家煙草專賣局創(chuàng)新平臺項目“靶向蛋白反向基因克隆與基于iTRAQ技術(shù)的煙草定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究”（023201302）；國家煙草專賣局煙草基因組計劃重大專項“煙草重要性狀基因發(fā)掘及功能標(biāo)記開發(fā)”[110201301008（JY-08）]

李曉青（1988-），女，碩士，主要從事煙草遺傳機(jī)理研究。E-mail：lxq82365393@163.com。*通信作者，E-mail：wangshaomei@caas.cn

2015-11-23

2016-05-06