呼 和，陳先江，程云湘

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

?

撂荒地亞硝酸還原酶基因nirK和nirS豐度動態(tài)

呼 和1，陳先江2，程云湘2

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

摘要：使用熒光定量PCR法測定亞硝酸還原酶基因(nirK和nirS)遺傳特異性片段，研究了草原撂荒地土壤反硝化微生物豐度隨著撂荒時間的變化。結(jié)果表明，輕度放牧草原和3種不同撂荒時間地的土壤中nirK基因型反硝化微生物豐度都顯著高于nirS基因型反硝化微生物豐度(P<0.05)。土壤nirK及nirS基因型反硝化微生物豐度撂荒地和輕度放牧地之間均有顯著差異(P<0.05)，但3種撂荒地均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。此外，這兩種基因型反硝化微生物豐度之間有極顯著線性負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.001)。以上結(jié)果說明，nirK和nirS基因型反硝化微生物對環(huán)境因子的響應(yīng)有差異。

關(guān)鍵詞：反硝化微生物；nirK基因；nirS基因；撂荒地；輕度放牧草原

由于人口迅速增長，我國對糧食及經(jīng)濟作物的需求量日益增大，因此，需要多種途徑擴大耕地面積，如開墾荒地、圍海造田、圍湖造田等，這就造成了草地退化等現(xiàn)象，如開墾已成為呼倫貝爾草原沙化、退化的主要原因之一[1]。近年來，國家開始實施退耕還林、還草等工程，以改善生態(tài)環(huán)境[2]。目前，國內(nèi)外關(guān)于退耕地的研究主要集中于植被群落的演替[3]、土壤理化性質(zhì)的變化[4]以及種植植物的影響[5-6]等方面，但隨著退耕時間的延長，土壤微生物群落如何變化，尤其是關(guān)于微生物氮循環(huán)重要環(huán)節(jié)之一——反硝化基因豐度變化及其相互關(guān)系的研究鮮見報道。生物反硝化作用是氮循環(huán)的主要環(huán)節(jié)之一，反硝化作用在土壤中普遍存在，其主要是通過微生物逐步地還原氮氧化合物，釋放出一氧化氮(NO)、氧化亞氮(N2O)和氮(N2)等，從而導(dǎo)致土壤中氮元素的減少，而且，N2O和NO的釋放可能導(dǎo)致全球變暖[7]。反硝化微生物廣泛分布于細(xì)菌和古菌中，在幾種真菌的線粒體中也發(fā)現(xiàn)了反硝化作用[8]。反硝化作用主要指在硝酸還原酶(Nar)、亞硝酸還原酶(Nir)、氧化亞氮還原酶(Nor)和一氧化二氮還原酶(Nos)等的作用下將硝酸鹽(NO3-)中的氮通過一系列中間產(chǎn)物(NO2-、NO、N2O)還原為氮氣(N2)的生物化學(xué)過程。其中，亞硝酸鹽向NO的還原酶和其它反硝化酶不同。首先，與其它反硝化反應(yīng)相比，亞硝酸還原酶把亞硝酸鹽還原為NO的反應(yīng)是將亞硝酸鹽還原成氣體的最初階段。其次，這個反應(yīng)由兩種不同類型的亞硝酸鹽還原酶(Nir)催化，這兩種酶存在于不同的細(xì)胞內(nèi)且結(jié)構(gòu)不同[8]。一種是nirS編碼的含細(xì)胞色素cd1的酶，一種是由nirK編碼的含銅的酶。據(jù)報道[9-10]，兩種亞硝酸鹽還原酶功能上沒有顯著差異，但是，如果土壤理化特性不同(如，氧、碳含量等)，有可能觀察到不同的反硝化微生物[11-12]或不同反硝化微生物群落[13-14]。然而，目前針對nirS和nirK基因豐度在不同特性土壤中的變化及其之間相互關(guān)系的研究較少。因此，本研究使用實時熒光定量PCR法初步探討在撂荒時間不同的耕地土壤中的nirS和nirK基因豐度的變化規(guī)律，以利于更好地理解撂荒地土壤反硝化作用，從而為管理撂荒地提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東北部的呼倫貝爾草原新巴爾虎右旗境內(nèi)(116° 40′ 18′′-117° 01′ 56′′ E，48° 32′ 00′′-48° 38′ 50′′ N)，為半干旱草原。試驗共設(shè)4個處理，3個撂荒農(nóng)田和1個輕度放牧草地。3個撂荒農(nóng)田的撂荒時間分別為1、5和25年(Y1、Y5和Y25)，輕度放牧草地(LG)設(shè)為對照，放牧率為1.4只羊·hm-2。在Y1、Y5和Y25樣點，玉米(Zeamays)、向日葵(Helianthusannuus)、圓柱披堿草(Elymuscylindricus)無規(guī)律輪作約40年，各樣地之間距離<10 km，且各樣點地勢相似，均為平地。各樣地2000-2009年平均溫度和降水量分別為1.6 ℃和213 mm，海拔在545～568 m，均為沙質(zhì)土壤。

1.2調(diào)查取樣及分析

在每個樣點隨機設(shè)5個1 m×1 m的樣方，于2010年8月進行植被調(diào)查和土壤取樣。記錄每個樣方內(nèi)的植物物種組成，測定樣方的蓋度、高度和密度，并計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。剪取植物地上部分，按物種分類，60 ℃下干燥48 h，稱重，測定地上植物干重。土壤濕度用TRIME-FM (Ettlingen，Germany)測定。另外，在每個樣方隨機選擇5個點收集0-10 cm土樣，混合為一個樣品，并移去表面有機質(zhì)和細(xì)根。把每個混合樣品分為兩部分，一部分過2 mm篩后密封于15 mL離心管中，放在液氮罐里運回實驗室，儲存于-80 ℃冰箱中待用于微生物試驗，另一部儲存于4 ℃下，用于測定土壤理化特性。土壤KCl浸提物中的NO3-N和NH4-N分別用鋅還原-萘乙二胺法[15]和靛酚藍(lán)比色法[16]測定，土壤磷含量用Truog法測定[17]，有機碳和總氮使用NC分析儀(Sumigraph NC-900；Sumika Chemical Analysis Service, Tokyo，Japan)采用干燃燒法測定[18]。土壤pH采用電位法測定。

1.3土壤DNA提取

每個土樣分別稱取3份，每份0.5 g，采用FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals，Illkirch，F(xiàn)rance)提取土壤DNA，實驗步驟按照說明書進行。采用SmartSpec Plus spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories，United States)測定DNA的純度及濃度。樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4熒光實時定量PCR(qPCR)

采用實時定量PCR(Applied Biosystems StepOne Plus 96-well，美國)與預(yù)混液(Applied Biosystems Power SYBR Green，美國)相對定量nirK和nirS基因片段，各反應(yīng)的引物、qPCR反應(yīng)條件、擴增片段大小、標(biāo)準(zhǔn)微生物及混合體系組成如表1和表2所示。qPCR反應(yīng)開始前先在95 ℃下進行10 min的酶活化。擴增產(chǎn)物的特異性通過觀察熔解曲線上的單一溶解峰和溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上特異條帶的出現(xiàn)來檢測。連續(xù)稀釋(10～107拷貝數(shù)·μL-1)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌對應(yīng)基因PCR擴增產(chǎn)物制作各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Eff=[10(-1/slope)-1]公式計算nirK和nirS基因擴增效率(Eff)，分別為92.0%和98.2%。每個反應(yīng)3個重復(fù)，平均拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為每克干土樣中的基因拷貝數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)分析

qPCR數(shù)據(jù)和環(huán)境因子特征采用SPSS 19.0(SPSS，Inc.，Chicago，IL，美國)進行方差分析(ANOVA)。ANOVA分析采用了Tukey’s test檢驗。如果每組數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布，在分析前將數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換。采用SIMCA-P 11.5(Umetrics AB，Umea，瑞典)分析軟件，偏最小二乘法(PLS)分析nirS和nirK基因拷貝數(shù)與環(huán)境因子之間的回歸系數(shù)和變量投影重要性(VIP)。

2結(jié)果與分析

2.1nirK和nirS基因豐度

開墾耕種活動顯著影響了nirK和nirS基因豐度比例(圖1)。撂荒地nirK基因的豐度是nirS基因的1 000倍左右，然而，在LG土壤中，nirK基因豐度是nirS基因10倍左右。隨著撂荒時間的延長，這兩種基因豐度都沒有顯著變化(P>0.05)，但是，3個撂荒地的nirK基因的豐度均顯著高于LG的(P<0.05)。另外，4個樣地亞硝酸還原酶基因nirK的拷貝數(shù)和nirS基因的拷貝數(shù)存在極顯著線性關(guān)系(圖2)，回歸方程為nirS=-0.696 (nirK)+9.650 7(R2=0.597 7，P<0.001)。

2.2環(huán)境因子與亞硝酸還原酶基因的相互作用

兩種亞硝酸還原酶基因(nirK和nirS)都與NH4-N、有機碳、總氮、植物多樣性和地上生物量顯著相關(guān)，VIP值均大于1(圖3)。由回歸系數(shù)值可知，nirK基因拷貝數(shù)與NH4-N、有機碳、總氮和地上生物量呈負(fù)相關(guān)，與植物多樣性呈正相關(guān)，而nirS基因的拷貝數(shù)與nirK基因的相關(guān)性分析結(jié)果正好相反。此外，pH、NO3-N、有效磷和H2O等環(huán)境因子對nirK和nirS基因的拷貝數(shù)無顯著影響，VIP值都小于1。

表1　nirK和nirS基因的qPCR條件及引物Table 1　qPCR Condition of nirK and nirS gene and primer

注：*表示降落。

Note:* means “touch down”.

表2　nirK和nirS基因的qPCR反應(yīng)體系Table 2　qPCR reaction system of nirK and nirS gene

圖1　撂荒地和輕度放牧草原土壤nirK和nirS基因豐度Fig.1　Abundance of nirK and nirS gene of soil of abandoned land and light-grazing steppe grassland

注：Y1撂荒1年；Y5撂荒5年；Y25撂荒年25年；LG輕度放牧地。不同小寫字母表示nirS和nirK基因豐度在不同樣地間差異顯著(P<0.05)。

Note: Y1, abandoned land with 1 year; Y5, abandoned land with 5 years; Y25, abandoned land with 25 years; LG, litght grazing grassland. Different lower case letters indicate significant difference of the same gene abundance among different plots at 0.05 level.

圖2　nirK和nirS基因豐度之間關(guān)系Fig.2　Relation between abundances of nirK and nirS gene

3討論與結(jié)論

土壤氮循環(huán)主要依賴于微生物的氮循環(huán)作用，即固氮、亞硝化、硝化及反硝化等作用把不同類型的氮素化合物改變?yōu)閬喯跛岣⑾跛岣?、NO及N2O的形式。其中，具有亞硝酸還原酶基因的微生物能把亞硝酸鹽還原為NO，是生物氮循環(huán)這一過程的重要影響環(huán)節(jié)之一，與其它參與生物氮循環(huán)基因相同，亞硝酸還原酶基因也是研究者關(guān)注的重要反硝化功能基因。因此，本研究以nirK和nirS基因作為研究對象，采用實時熒光PCR法探討了不同類型亞硝酸還原酶基因豐度在呼倫貝爾草原不同撂荒時間耕地土壤中的動態(tài)變化以及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，撂荒地和輕度放牧草原的土壤理化特征及植被狀況差異較大[19]。3個撂荒地的地上生物量有顯著差異(P<0.05)，但銨態(tài)氮、有效磷、有機碳和植物多樣性無顯著差異(P>0.05)[19]。此外，Y5樣地的土壤pH和硝酸鹽氮(NO3-N)顯著高于Y1和Y25，Y1和Y25之間無顯著差異。Y5的總氮顯著高于Y1的(P<0.05)，但Y25的與Y1和Y5的均無顯著差異。Y25的土壤水分含量(H2O)顯著高于Y1的，Y5的與Y1、Y25的均無顯著差異[19]。

在3個不同撂荒時間的撂荒地土壤中，nirK基因豐度顯著高于nirS基因，前者均約為后者的103倍，而在輕度放牧草原土壤中，前者約為后者的10倍，這說明該研究地土壤中具有nirK基因的微生物是主要的亞硝酸還原微生物。在森林土壤(壤土和粉壤土)[20]和稻田土壤[21]中也得到了相同的結(jié)果，即nirK基因豐度高于nirS基因豐度。此外，在撂荒地土壤中nirK和nirS基因豐度分別顯著高于和低于輕度放牧草原。根據(jù)PLS分析的結(jié)果，植物多樣性和nirK基因豐度之間有顯著正相關(guān)(VIP=1.05)，表明nirK類型反硝化微生物有可能很容易受不同組成和數(shù)量的根系分泌物的影響，在沙壤土中，隨著植被多樣性的變化其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也變化[22]，Bremer等[23]使用狐尾草(Alopecuruspratensis)、黃花茅(Anthoxanthumodoratum)、燕麥草(Arrhenatherumelatius)、絨毛草(Holcuslanatus)、老鸛草(Geraniumpratense)、車前(Plantagolanceolata)、毛茛(Ranunculusacris)和蒲公英(Taraxacumofficinale)的微宇宙試驗中發(fā)現(xiàn)，不同植物微宇宙土壤有不同的nirK群落結(jié)構(gòu)。Baneras等[24]也指出植被類型的改變對nirK類型反硝化微生物群落具有顯著影響。除此之外，NH4-N、有機碳、總氮和地上生物量對于nirK和nirS基因豐度分別呈顯著負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系(VIP > 1)(圖3)，說明亞硝酸還原細(xì)菌的豐度變化受到土壤不同理化性質(zhì)的共同影響，導(dǎo)致兩種類型亞硝酸還原細(xì)菌豐度呈此消彼長的趨勢，nirK和nirS基因豐度之間呈極顯著線性關(guān)系(P<0.001)(圖2)。許多研究[25-27]表明，土壤微生物的分布、活動、多樣性以及豐度與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)。Maag和Vinther[28]在森林土壤中發(fā)現(xiàn)，反硝化速率受多個環(huán)境因子聯(lián)合調(diào)控。 盡管nirK和nirS基因與NO3-N的含量密切相關(guān)，而本研究未發(fā)現(xiàn)nirK和nirS基因豐度與NO3-N含量具有顯著相關(guān)性，這有可能是在自然環(huán)境土壤中不同環(huán)境因子共同影響亞硝酸還原微生物的結(jié)果。許多研究者也在不同環(huán)境的土壤中發(fā)現(xiàn)了反硝化細(xì)菌群落與NO3-N含量具有很弱的相關(guān)性[29-31]。此外，Kong等[32]認(rèn)為，在亞硝酸還原微生物生存的微生境中，其變化有可能與NO3-N含量變化無關(guān)。

圖3　各環(huán)境因子和nirK，nirS基因豐度之間的回歸系數(shù)及VIP值Fig.3　Regression coefficient between each environmental factors and abundance of nirK and nirS, and VIP value

總之，在本研究區(qū)的撂荒地，nirK和nirS基因型反硝化微生物豐度隨著撂荒時間無有顯著變化，然而它們之間有顯著線性關(guān)系，兩種基因型反硝化微生物隨著環(huán)境因子的變化，有可能互補調(diào)節(jié)亞硝酸鹽還原為NO的作用。但本研究只分析了DNA水平上的反硝化微生物豐度，其活性及表達的規(guī)律還有待RNA樣品來分析說明。另外，尚需開展nirK和nirS基因型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和分布，以便了解隨著撂荒時間的延長反硝化微生物群落的演替規(guī)律，更科學(xué)地通過調(diào)節(jié)反硝化作用管理撂荒地。

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(責(zé)任編輯武艷培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0751

*收稿日期：2015-12-31接受日期：2016-03-20

基金項目：草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室(蘭州大學(xué))開放基金項目(SKLGAE201407)；國家自然科學(xué)基金項目(31460029、31402118)；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項(2013GAAS04-04)

通信作者：程云湘(1977-)，女，山東菏澤人，副教授，博士，主要從事草地生態(tài)、草地溫室氣體排放研究。E-mail:chengyx@lzu.edu.cn

中圖分類號：S812.29

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)7-1253-07*

Corresponding author:Cheng Yun-xiangE-mail:chengyx@lzu.edu.cn

The dynamics for abundance of nitrite reductase genesnirKandnirSin abandoned land

Huhe1, Chen Xian-Jiang2, Cheng Yun-Xiang2

(1.Institute of Soil and Fertilizer and Save Water Agricultural, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China；2.State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Abstract:Determination of nitrite reductase gene (nirK and nirS) specific fragment by real-time quantitative PCR method, we studied the dynamics of denitrification microbial abundance in abandoned land soil with different abandoned years. The results showed that the nirK genotype denitrifier abundance were significantly higher than nirS genotype denitrifier abundance in 3 kinds of abandoned land for 1, 5, and 25 years and light grazing grassland. Both of genotypes denitrifier abundance were significant difference between the light grazing grassland and the three abandoned land soils (P<0.05), but there was no significant change among the 3 kinds of abandoned land soil. Moreover, there were extremely significantly negative linear relationship between the two genes abundance in the investigation soils (P<0.001), indicating that the nirK and nirS show different response to the environmental factors on their growth.

Key words：denitrifier; nirK gene; nirS gene; abandoned land; light-grazing grassland

呼和,陳先江,程云湘.撂荒地亞硝酸還原酶基因nirK和nirS豐度動態(tài).草業(yè)科學(xué),2016,33(7)：1253-1259.

Huhe,Chen X J,Cheng Y X.The dynamics for abundance of nitrite reductase genesnirKandnirSin abandoned land.Pratacultural Science，2016,33(7)：1253-1259.

第一作者：呼和(1976-)，男(蒙古族)，內(nèi)蒙古通遼人，副研究員，博士，主要從事環(huán)境污染的微生物修復(fù)、農(nóng)牧業(yè)固體廢棄物循環(huán)利用和微生物生態(tài)研究。E-mail:huhecyxw@yahoo.co.jp