陳珊珊，鐘其頂，俞慧紅，黃占斌，王道兵，戴　祁

(1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京　100083；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京　100027；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京　100027；4.慈溪市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 慈溪　315300)

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植物油中甘油穩(wěn)定碳同位素組成的測(cè)定

陳珊珊1,2,3，鐘其頂2,3，俞慧紅4，黃占斌1，王道兵2,3，戴祁2,3

(1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京100027；4.慈溪市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 慈溪315300)

摘要：建立了氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)法結(jié)合酯交換技術(shù)測(cè)定植物油中甘油的穩(wěn)定碳同位素組成(δ13C)。樣品溶于異辛烷后，在氫氧化鉀-甲醇溶液中轉(zhuǎn)化為甘油和脂肪酸甲酯，去除脂肪酸甲酯后用GC-C-IRMS法測(cè)定甘油的δ13C。結(jié)果表明，食用油中甘油δ13C的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18‰，且酯交換過(guò)程不會(huì)導(dǎo)致甘油碳同位素分餾。通過(guò)分別測(cè)定玉米胚芽油、大豆油和玉米胚芽油與大豆油的混合植物油中甘油的δ13C值，并進(jìn)行結(jié)果比較，表明甘油δ13C值與玉米胚芽油中大豆油的含量呈顯著負(fù)相關(guān)(R2=0.98)，可通過(guò)測(cè)定甘油δ13C值驗(yàn)證大豆油摻入玉米胚芽油的比例。本方法前處理簡(jiǎn)單、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于食用油摻假的鑒定。

關(guān)鍵詞：植物油；甘油；穩(wěn)定同位素；摻假

我國(guó)是世界上最大的糧油生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，糧油消費(fèi)量逐年攀升，其質(zhì)量安全事關(guān)國(guó)民健康。由于我國(guó)食用油行業(yè)準(zhǔn)入制度并不完善，生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)低，導(dǎo)致食用油產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊[1]。另外，長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)食用油生產(chǎn)、供應(yīng)、流通體系較為復(fù)雜，檢測(cè)手段和含量標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，導(dǎo)致質(zhì)量監(jiān)管、監(jiān)督難度較大，難于保障食用油的品質(zhì)安全。食用油中的植物油因種類不同、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同而價(jià)格差異很大，一些生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者為了牟取暴利，在高價(jià)植物油中摻入廉價(jià)的植物油，如在芝麻油中摻入菜籽油、棉籽油、大豆油、葵花油；在菜油中摻入棕櫚油、棉籽油；在橄欖油中摻入玉米油、核桃油等；更有甚者，在植物油中直接摻入潲水油，這極大地?fù)p害了廣大消費(fèi)者的利益[2]。

目前，鑒別食用植物油摻雜的檢測(cè)方法有氣相色譜法、折光率法、紅外光譜法和紫外分光光度法等，但將穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)用于食用植物油的摻雜鑒別在我國(guó)尚處于起步階段[3-10]。穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻假鑒定中具有重要作用，現(xiàn)已成功應(yīng)用于果汁摻水、摻糖分析，蜂蜜摻糖，谷物和水果酒精的質(zhì)量評(píng)價(jià)及植物學(xué)來(lái)源等多個(gè)方面[7]。Kelly等[8]應(yīng)用該技術(shù)測(cè)定了植物油中脂肪酸的碳同位素值，甄別了常見(jiàn)植物油的真?zhèn)危唤鹎嗾艿萚11-12]利用脂肪酸中碳同位素比值法檢測(cè)花生油和玉米油摻合物，成功鑒別了花生油和玉米油。植物油中脂肪酸的種類眾多，且在不同植物油中的含量差異較大，分餾影響因素不明確，但甘油是各種植物油中所共有的，是植物代謝的最終產(chǎn)物[13-17]，各種甘油三酯中的甘油之間存在相似性[18]，因此，可以通過(guò)比較植物油中甘油的碳穩(wěn)定同位素比值鑒定植物油的摻假程度。雖然Fronza等[19]通過(guò)比較甘油的δ13C值鑒別了甘油來(lái)源，但是，還未見(jiàn)通過(guò)分析植物油中甘油穩(wěn)定同位素分布鑒別植物油真?zhèn)蔚膱?bào)道。

本工作以常見(jiàn)的植物油為研究對(duì)象，通過(guò)分析其中的甘油碳同位素分布特征，討論其主要的影響因素，探索應(yīng)用氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)法鑒別植物油產(chǎn)品真?zhèn)蔚目尚行浴?/p>

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與設(shè)備

Delta V advantage 氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；3K15冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；ZH7924電熱恒溫水浴箱：北京中慧天誠(chéng)科技有限公司產(chǎn)品；AB204-N萬(wàn)分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；真空泵：上海置信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：美國(guó)Scientific Industries公司產(chǎn)品。

1.2材料與試劑

玉米胚芽油、大豆油等植物油樣品：均為購(gòu)于市場(chǎng)的純植物油；甘油：δ13CPDB為-30.98‰，標(biāo)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]；氫氧化鉀粉末，無(wú)水硫酸鈉，異辛烷，甲醇：均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

氫氧化鉀-甲醇溶液的配制：稱取13.1 g氫氧化鉀粉末，溶于100 mL甲醇中，可輕微加熱，然后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，真空抽濾后得到澄清的氫氧化鉀-甲醇溶液，于4 ℃冷藏備用。

1.3樣品前處理

稱取0.12 g植物油于10 mL離心管中，加入8 mL異辛烷，旋轉(zhuǎn)振蕩2 min，使植物油充分溶于異辛烷；再加入400 μL氫氧化鉀-甲醇溶液，充分振蕩，靜置，使油脂水解完全。棄去上層溶液，在下層溶液中加入鹽酸調(diào)至pH 5.0以下，靜置30 min，去除上層多余的脂肪酸，再用氫氧化鉀-甲醇溶液調(diào)至pH 7。加入1 mL甲醇，使甘油溶液中的KCl析出，用離心機(jī)離心使KCl沉淀，取上層甘油溶液，待測(cè)。

1.4GC-C-IRMS法測(cè)定甘油中δ13C

色譜條件：HP-Innowax毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣；載氣流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度270 ℃；升溫程序：起始溫度120 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1。

分離甘油和甲醇后，將甲醇排出，僅將甘油倒入燃燒轉(zhuǎn)化裝置中進(jìn)行反應(yīng)。燃燒轉(zhuǎn)化裝置中配置陶瓷(Al2O3)氧化管，填料為CuO、NiO和Pt，工作溫度為1 000 ℃，將甘油轉(zhuǎn)化成CO2后，再用IRMS測(cè)定。

δ13C可用式(1)計(jì)算：

(1)

式中，R樣品為樣品中13C與12C的比值；R標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)南卡羅來(lái)納州白堊紀(jì)皮狄組層位中的擬箭石化石標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(V-PDB)中13C與12C的比值，13C/12C=(11 237.2±90)×10-6。

2結(jié)果與討論

2.1方法的重復(fù)性

按1.4節(jié)方法測(cè)定甘油標(biāo)準(zhǔn)品，m/z 44、45、46的離子譜圖示于圖1。由圖1可見(jiàn)，采用該方法測(cè)定甘油的δ13C值，可有效避免其他有機(jī)物質(zhì)的干擾。為考察方法的重復(fù)性，配制一定濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)品，按1.4節(jié)方法重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果列于表1。可以看出，5次重復(fù)測(cè)定的甘油標(biāo)準(zhǔn)品碳穩(wěn)定同位素比值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21‰，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的應(yīng)用液相色譜-同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定甘油δ13C得到的結(jié)果相同。

圖1　甘油標(biāo)準(zhǔn)品的δ13C譜圖

2.2甘油濃度對(duì)測(cè)定的影響

由于連續(xù)流-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定氣體的同位素組成易受分餾效應(yīng)的影響，導(dǎo)致同一氣體在不同進(jìn)樣量時(shí)得到的同位素測(cè)定值可能存在一些差異，因此，本實(shí)驗(yàn)在分析儀器測(cè)定參考?xì)釩O2的線性范圍基礎(chǔ)上(±0.057‰)，以不同濃度的甘油-甲醇溶液驗(yàn)證儀器的有效測(cè)定范圍。分別配制3、5、7、9 g/L甘油溶液，按1.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定5次，結(jié)果示于圖2。不同濃度的甘油-甲醇溶液對(duì)應(yīng)的m/z44信號(hào)強(qiáng)度范圍為1 800～5 000 mV，δ13C值的波動(dòng)范圍為-30.12‰～-31.52‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39‰。結(jié)果表明，甘油濃度為3、5、7、9 g/L時(shí)，δ13C值的測(cè)定結(jié)果是一致的，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.62‰、0.33‰、0.19‰、0.34‰，并且以7 g/L甘油溶液測(cè)得的δ13C值最為集中，波動(dòng)范圍最小。因此，選擇7 g/L甘油溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　甘油標(biāo)準(zhǔn)品的δ13C值重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

圖2　不同濃度甘油溶液中，甘油δ13C的測(cè)定結(jié)果

2.3樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取過(guò)程對(duì)甘油碳穩(wěn)定同位素分餾的影響自然界中存在著廣泛的穩(wěn)定同位素分餾作用，若轉(zhuǎn)化/收集不完全，由于不同穩(wěn)定同位素構(gòu)成的分子質(zhì)量差異，其含量易出現(xiàn)變化。為了保證甘油碳穩(wěn)定同位素測(cè)定的準(zhǔn)確性，需要驗(yàn)證碳穩(wěn)定同位素在提取甘油的前處理過(guò)程中是否會(huì)產(chǎn)生分餾現(xiàn)象。以某種玉米油為例，稱取0.12 g樣品，分別加入0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 g甘油標(biāo)準(zhǔn)品，將其編號(hào)為1、2、3、4、5。按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，按1.4節(jié)方法平行測(cè)定3次，得到樣品的δ13C值。根據(jù)加入甘油標(biāo)準(zhǔn)品的比例計(jì)算樣品中甘油碳穩(wěn)定同位素比值的理論值，然后將測(cè)定值與理論值進(jìn)行比較，結(jié)果列于表2?？梢?jiàn)，添加不同比例甘油標(biāo)準(zhǔn)品的碳穩(wěn)定同位素比值的測(cè)定值與理論值的差值均在1.5‰以內(nèi)，處于未添加的甘油樣品δ13C值的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。

表2　添加不同比例甘油標(biāo)準(zhǔn)品后，

圖3　添加不同比例甘油標(biāo)準(zhǔn)品后，甘油樣品的δ13C測(cè)定值

為了驗(yàn)證該處理方法對(duì)甘油中的碳穩(wěn)定同位素沒(méi)有產(chǎn)生分餾作用，對(duì)測(cè)定值進(jìn)行線性分析，結(jié)果示于圖3。添加甘油標(biāo)準(zhǔn)品的比例的計(jì)算公式示于式(2)：

(2)

式中：N為添加甘油標(biāo)準(zhǔn)品的比例；m1為在玉米油中添加甘油標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量；m2為玉米油在水解過(guò)程中產(chǎn)生的甘油的質(zhì)量。

玉米油的主要成分為甘油三酯，其在氫氧化鉀-甲醇溶液的作用下可水解得到高級(jí)脂肪酸和甘油。玉米油在水解過(guò)程中產(chǎn)生的甘油質(zhì)量m2可用式(3)計(jì)算：

(3)

式中：m為玉米油的質(zhì)量；M1為甘油的相對(duì)分子質(zhì)量(參考值92)；M2為甘油三酯的相對(duì)分子質(zhì)量(參考值639)。

由圖3可見(jiàn)，添加不同比例甘油標(biāo)準(zhǔn)品的碳穩(wěn)定同位素比值具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.98。由表2可見(jiàn)，隨著加入甘油標(biāo)準(zhǔn)品比例的增加，甘油的δ13C值呈現(xiàn)不斷變小的趨勢(shì)，并且與計(jì)算得出的理論值十分接近，這說(shuō)明在前處理過(guò)程中甘油碳穩(wěn)定同位素沒(méi)有發(fā)生分餾。

2.3.2前處理過(guò)程對(duì)分析的影響植物油在堿性條件下可水解得到脂肪酸和甘油，但是反應(yīng)時(shí)間過(guò)短則會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)不充分，生成的甘油濃度過(guò)低等現(xiàn)象，從而造成甘油δ13C值測(cè)定不準(zhǔn)確。油脂在水解過(guò)程中，加入氫氧化鉀-甲醇溶液充分振蕩后，靜置1 h，平行測(cè)定3次，得到甘油δ13C值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74‰。在其他條件不變的情況下，加入氫氧化鉀-甲醇溶液并充分振蕩后，分別靜置2、3、4、5 h，平行測(cè)定3次，結(jié)果列于表3。可見(jiàn)，甘油δ13C值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20‰、0.16‰、0.11‰和0.12‰，說(shuō)明靜置4 h可使前處理?xiàng)l件達(dá)到最優(yōu)。

表3　不同前處理過(guò)程下，甘油δ13C值測(cè)定結(jié)果

2.4樣品前處理的穩(wěn)定性

為了研究該方法測(cè)定植物油中甘油δ13C的穩(wěn)定性，以大豆油為研究對(duì)象，取5份樣品按1.3節(jié)方法處理，按1.4節(jié)方法測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次。分析甘油的碳同位素比值測(cè)定數(shù)據(jù)之間的穩(wěn)定系數(shù)，結(jié)果列于表4。由表4可見(jiàn)，重復(fù)測(cè)定的5份甘油樣品的碳穩(wěn)定同位素比值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18‰，說(shuō)明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.5不同比例混合植物油中甘油δ13C值變化規(guī)律

作為C4植物油玉米胚芽油與作為C3植物油的大豆油的轉(zhuǎn)化途徑不同，它們之間的δ13C值相差較大[12]。為了驗(yàn)證上述方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，選取玉米胚芽油和大豆油進(jìn)行水解，對(duì)得到的甘油連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得結(jié)果顯示，玉米胚芽油和大豆油的δ13C值分別為-14.71‰和-31.30‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.23‰和0.18‰。

表4　5份甘油樣品δ13C穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

將大豆油按照0%、25%、50%、75%和100%的比例摻入到玉米胚芽油中，經(jīng)前處理后，檢測(cè)甘油碳穩(wěn)定同位素值；然后以甘油的δ13C值為縱坐標(biāo)，大豆油-玉米胚芽油混合比例為橫坐標(biāo)，繪制甘油δ13C值的線性圖，示于圖4。由圖4可知，甘油δ13C值與大豆油的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明可通過(guò)測(cè)定甘油δ13C值驗(yàn)證大豆油中摻入玉米胚芽油的比例。

圖4　大豆-玉米胚芽混合油中甘油δ13C值的線性圖

3結(jié)論

本研究建立了從植物油中提取甘油的方法，該方法簡(jiǎn)單快捷、穩(wěn)定性好，且對(duì)甘油中碳穩(wěn)定同位素不產(chǎn)生分餾作用。實(shí)驗(yàn)采用GC-C-IRMS法測(cè)定植物油中甘油的δ13C值，該測(cè)定值可以有效地鑒別出大豆油中摻入玉米胚芽油的現(xiàn)象。但由于本研究的樣品量較少，且僅對(duì)甘油的碳穩(wěn)定同位素進(jìn)行了探討性研究，今后還需將其與植物油中脂肪酸的穩(wěn)定同位素測(cè)定相結(jié)合，使其在植物油真?zhèn)舞b定方面的研究更深入。

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收稿日期：2015-09-29;修回日期：2015-12-22

基金項(xiàng)目：科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2015DFA31720)；北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金課題(2015BZ0063-04)資助

作者簡(jiǎn)介：陳珊珊(1990—)，女(漢族)，河南人，碩士研究生，從事糧油品種鑒別研究。E-mail: chenshan900429@163.com 通信作者：鐘其頂(1980—)，男(漢族)，廣西人，高級(jí)工程師，從事穩(wěn)定同位素食品分析技術(shù)研究。E-mail: zhongqiding@163.com

中圖分類號(hào)：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2997(2016)04-0359-07

doi：10.7538/zpxb.2016.37.04.0359

Determination of the Stable Carbon Isotopic Composition of Glycerol in Vegetable Oils

CHEN Shan-shan1,2,3, ZHONG Qi-ding2,3, YU Hui-hong4,HUANG Zhan-bin1, WANG Dao-bing2,3, DAI Qi2,3

(1.SchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,ChinaUniversityofMiningandTechnology,Beijing100083,China;2.ChinaNationalInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100027,China;3.NationalStandardizationCenterofFood&FermentationIndustry,Beijing100027,China;4.CixiCenterforFoodandDrugControl/Testing,Cixi315300,China)

Abstract:A method of gas chromatography-combustion-stable isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) with ester exchange technology was established for the determination stable carbon isotope composition (δ13C) of glycerol in vegetable oils. After the sample was dissolved in isooctane, triglyceride produces glycerol and fatty acid methyl ester under the existence of KOH methanol solution. δ13C of glycerol was determined by GC-C-IRMS after the removal of fatty acid methyl ester. Through the optimization of reaction time, the best time is 4 h after addition of KOH methanol solution. Results show that the standard deviation is 0.18‰, and the ester exchange process does not lead to glycerol carbon isotope fractionation. By analysing the differences of δ13C value of glycerol in corn oil and soybean oil, δ13C values are -14.71‰ and -31.30‰, respectively, δ13C value of glycerol has a significant negative correlation (R2=0.98) with content of soybean oil in corn germ oil. The method has an advantage of easy and rapid operation, and which is applicable for δ13C analysis of adulteration of vegetable oil. This study provides a theoretical basis and technical support for the identification of varieties of vegetable oils.

Key words：vegetable oil; glycerol; stable isotope composition; adulteration