羅益遠(yuǎn)，劉娟秀，劉　廷，劉訓(xùn)紅，蘭才武，王勝男，華愉教

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京　210023；2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司，貴州 凱里　556000)

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UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定何首烏中二苯乙烯、蒽醌、黃酮及酚酸類成分

羅益遠(yuǎn)1，劉娟秀1，劉廷1，劉訓(xùn)紅1，蘭才武2，王勝男1，華愉教1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023；2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司，貴州 凱里556000)

摘要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定何首烏中二苯乙烯(二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜蘆醇)、蒽醌(大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸)、黃酮(表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素)和酚酸(沒(méi)食子酸)等4類共14種目標(biāo)成分的方法。何首烏樣品用70%甲醇在室溫下以料液比1∶25超聲提取45 min，提取液以12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)，以水(含0.1%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，柱溫35 ℃，體積流量0.25 mL/min，電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：14種目標(biāo)化合物在一定濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.991 5；精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；加樣回收率在95.85%～102.13%之間，RSD均小于5%。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于何首烏中多元功效物質(zhì)或指標(biāo)成分的同時(shí)測(cè)定，為何首烏藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考。

關(guān)鍵詞：何首烏；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；二苯乙烯類；蒽醌；黃酮；酚酸

何首烏為大宗常用中藥材，系蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便之功效，用于瘡癰、瘰疬、腸燥便秘等癥狀。制首烏是何首烏的炮制加工品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨之功效，常用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、高血脂等癥狀，自古便為延年益壽之補(bǔ)品[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，何首烏中的二苯乙烯苷是一種植物抗毒素，是藥材中特有的生物活性成分，具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫力、防止動(dòng)脈硬化、保護(hù)肝臟的作用[3-4]；蒽醌類化合物具有調(diào)血脂、抗菌、強(qiáng)心、抗癌、保護(hù)心肌、潤(rùn)腸通便的作用[5]；黃酮及酚酸類成分除具有抗氧化作用外，還有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖血脂等多方面的生理活性[6]。

目前，對(duì)于何首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)分析方法主要有薄層色譜法[7-8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。與HPLC法相比，超高效液相色譜法(UPLC)具有分離效率高、峰容量大及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，更適于中藥復(fù)雜體系的分離分析；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量分析，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)做中性碎片掃描，可解決HPLC難以分離復(fù)雜體系的問(wèn)題。MS/MS與MS相比，靈敏度及選擇性均顯著提高，在復(fù)雜樣品測(cè)定中，MS/MS能降低信噪比，消除基質(zhì)干擾，同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠[16-17]。

針對(duì)何首烏多指標(biāo)多類型藥效成分的特點(diǎn)，通過(guò)建立同時(shí)測(cè)定多指標(biāo)成分含量的方法，探討多指標(biāo)成分的評(píng)價(jià)體系，使其更具實(shí)用性和有效性。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上[18-21]，擬采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定何首烏中3種二苯乙烯(二苯乙烯苷、虎杖苷和白藜蘆醇)、5種蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚)、5種黃酮(表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷和槲皮素)和1種酚酸(沒(méi)食子酸)等14種目標(biāo)成分的含量，旨為何首烏藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器

AcquityTM超高效液相色譜儀、XevoTQ質(zhì)譜系統(tǒng)、MasslynxV4.1 工作站：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；KQ-500B超聲波清洗機(jī)：超聲功率500W，頻率40kHz，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品；BSA2245型電子分析天平(精度十萬(wàn)分之一)、ME36S型電子分析天平(精度百萬(wàn)分之一)：均為德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；H1650-W高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

二苯乙烯苷(批號(hào)：110844-200607)、大黃素(批號(hào)：110756-200110)、蘆薈大黃素(批號(hào)：0795-9803)、大黃酸(批號(hào)：0757-200206)、大黃素甲醚(批號(hào)：0758-200206)、表兒茶素(批號(hào)：10878-200102)、沒(méi)食子酸(批號(hào)：110831-200302)、槲皮素(批號(hào)：100081-200907)、蘆丁(批號(hào)：0080-9705)、金絲桃苷(批號(hào)：111521-200303)、紫云英苷(批號(hào)：11092001)：純度均大于98%，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；虎杖苷(批號(hào)：YY90052)、白藜蘆醇(批號(hào)：YY90051)、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷(批號(hào)：YY90555)：純度均大于98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；水為超純水：由Millipore純水器制備；乙腈、甲醇(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：美國(guó)ROE公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。14種目標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1。

何首烏藥材：均為實(shí)地采集或購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幉墓?。制首烏藥材編?hào)及來(lái)源如下：S1～S4為江蘇產(chǎn)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院提供(批號(hào)分別為：121122，130223，130314，131201)；S5為廣東產(chǎn)，由南京宣德堂中醫(yī)門診藥房提供；S6為四川產(chǎn)，由江蘇省中醫(yī)院提供(批號(hào)為131209)；S7為湖北產(chǎn)，由南京大華中藥店提供(批號(hào)為131101)；S8為四川產(chǎn)，由南京益大藥店提供(批號(hào)為131207)；S9為廣東產(chǎn)，由北京同仁堂南京店提供(批號(hào)為130512002)；S10為四川產(chǎn)，由南京益豐大藥房提供(批號(hào)為130812)；S11和S12為實(shí)地采集于貴州省赫章縣的生首烏，根據(jù)《中國(guó)藥典》[1]何首烏的燉法和蒸法制得對(duì)應(yīng)的制何首烏樣品。所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為何首烏PolygonummultiflorumThunb.的塊根，留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

圖1　14種目標(biāo)成分的結(jié)構(gòu)式

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：水(含0.1%甲酸)(A相)-乙腈(B相)；梯度洗脫：0～1 min、10%B，1～2 min、10%～90%B，2～3 min、90%B，3～4 min、90%～10%B，4～5 min、10%B；柱溫35 ℃；流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件Waters三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(TQD)，電噴霧離子化源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式(MRM)測(cè)定。脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣流速50 L/h；正離子模式下，毛細(xì)管電壓3.5 kV，脫溶劑氣流速800 L/h；負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓2.5 kV，脫溶劑氣流速550 L/h。14種目標(biāo)成分的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1　14種目標(biāo)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取6.42 mg表兒茶素、2.11 mg蘆丁、1.50 mg金絲桃苷、21.3 mg二苯乙烯苷、1.78 mg紫云英苷、2.63 mg白藜蘆醇、1.55 mg槲皮素、5.49 mg沒(méi)食子酸、0.27 mg蘆薈大黃素、1.34 mg大黃酸、25.20 mg大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、14.85 mg大黃素、23.8 mg虎杖苷、14.60 mg大黃素甲醚對(duì)照品，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度；取適量的各對(duì)照品母液，加甲醇配制成含上述對(duì)照品的混合儲(chǔ)備液，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.3.4供試品溶液的制備取干燥至恒重的樣品粉碎，過(guò)80目篩，精密稱定1.0 g樣品粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱其質(zhì)量，于室溫下超聲提取45 min后取出，冷卻，以70%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，靜置冷卻，平行制得2份樣品，于4 ℃保存。測(cè)定時(shí)，精密吸取1 mL溶液，置于100 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸溶液(1∶9，V/V)定容，搖勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.4分析方法

用Waters BEH C18色譜柱對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的分離條件。按照選定的最佳色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，平行測(cè)定2次，通過(guò)外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分的含量。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等溶劑作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，在流動(dòng)相中加入一定比例的甲酸可以增強(qiáng)樣品中待測(cè)物的保留，并減少色譜峰的拖尾，提高分析方法的分離效果和靈敏度。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選用正負(fù)兩種離子模式測(cè)定14種目標(biāo)成分的含量，其中，二苯乙烯苷、白藜蘆醇、大黃酸選擇負(fù)離子模式，其他成分選擇正離子模式。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各成分在檢測(cè)條件下具有較好的穩(wěn)定性、較高的響應(yīng)值和較好的峰形。

2.3供試品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑(60%、70%、80%、90%、100%甲醇)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)及提取時(shí)間(15、30、45、60 min)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以70%甲醇作為溶劑，料液比1∶25、超聲提取45 min時(shí)的提取率最高。

2.4線性方程、檢測(cè)限和定量限

精密吸取1.3.3節(jié)的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水溶液(1∶9，V/V)逐級(jí)稀釋，制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1節(jié)和2.2節(jié)條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)和線性范圍；以各化合物的3倍信噪比(S/N=3)相對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢測(cè)限(LOD)，以各化合物的10倍信噪比(S/N=10)相對(duì)應(yīng)的濃度為最低定量限(LOQ)，結(jié)果列于表2，混合對(duì)照品的色譜圖示于圖2。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取5 μL同一混合對(duì)照溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算14種目標(biāo)成分峰面積的RSD；取同一樣品，按1.3.4節(jié)方法制備供試品溶液，吸取5 μL進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各目標(biāo)成分含量的RSD；取同一樣品制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定14種目標(biāo)成分峰面積的RSD，結(jié)果列于表3。

2.5.2加樣回收率實(shí)驗(yàn)取0.5 g(6份)已知含量的樣品，精密稱定，置于錐形瓶中，分別加入一定量的各對(duì)照品溶液，按1.3.4節(jié)方法制備加樣回收率供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定后，計(jì)算各成分的平均回收率及RSD，結(jié)果列于表3。

2.6樣品含量測(cè)定及分析

取按1.3.4節(jié)方法制備的何首烏供試品溶液，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)條件測(cè)定，根據(jù)相應(yīng)的線性關(guān)系計(jì)算供試樣品中14種目標(biāo)成分的含量和變異系數(shù)(變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)，結(jié)果列于表4。

表2　14種化合物的線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

注：1.表兒茶素；2.蘆丁；3.金絲桃苷；4.二苯乙烯苷；5.紫云英苷；6.白藜蘆醇；7.槲皮素；8.沒(méi)食子酸；9.蘆薈大黃素；10.大黃酸；11.大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷；12.大黃素；13.虎杖苷；14.大黃素甲醚圖2　14種目標(biāo)成分混合對(duì)照品的MRM色譜圖

化合物精密度RSD/%重復(fù)性RSD/%穩(wěn)定性RSD/%加樣回收率平均回收率/%RSD/%表兒茶素0.682.573.2198.832.72蘆丁2.02——102.132.07金絲桃苷1.950.851.6097.772.49二苯乙烯苷1.061.162.32101.322.84紫云英苷1.861.972.1295.851.93白藜蘆醇0.771.772.6799.042.89槲皮素2.532.013.6497.153.22沒(méi)食子酸2.190.540.81100.923.85蘆薈大黃素1.242.451.8096.582.54大黃酸0.881.042.6299.672.40大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷1.061.563.08101.134.15大黃素1.451.772.2295.992.85虎杖苷0.432.132.89101.263.55大黃素甲醚1.722.313.1899.441.99

結(jié)果表明，制首烏樣品中二苯乙烯苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為8.495～35.979 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.803 mg/g；其次為大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素、虎杖苷和大黃素甲醚，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.424、5.267、2.638、4.244 mg/g。這5種成分總含量占制首烏的2.23%以上。此外，表兒茶素、沒(méi)食子酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.504、0.717 mg/g?！吨袊?guó)藥典》2015版中規(guī)定：二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚是制首烏質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分，其最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為35.979、15.723、8.307 mg/g，最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.495、2.022、1.715 mg/g，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

由表4可見(jiàn)，同一成分在各產(chǎn)地何首烏樣品中的含量差異明顯，不同成分的變化或波動(dòng)范圍也明顯不同，且不同炮制方法制備的制首烏樣品化學(xué)成分差異明顯。為了比較不同成分含量的波動(dòng)差異，引入了質(zhì)量變異系數(shù)，其數(shù)值可以反映某一成分在不同樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異的范圍。其中，表兒茶素、蘆薈大黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異系數(shù)較大，分別為0.94、0.82，而白藜蘆醇的變異系數(shù)相對(duì)較小。這說(shuō)明，制首烏中表兒茶素和蘆薈大黃素可能比白藜蘆醇更容易受到產(chǎn)地的因素影響而產(chǎn)生變化。

3結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定何首烏中3種二苯乙烯(二苯乙烯苷、虎杖苷和白藜蘆醇)、5種蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚)、5種黃酮(表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷和槲皮素)和1種酚酸(沒(méi)食子酸)等14種目標(biāo)成分的定性、定量分析方法，通過(guò)優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件，確定最佳的提取條件為：70%甲醇作為溶劑，料液比1∶25、超聲提取45 min。結(jié)果表明，14種化合物的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.991 5，平均回收率在95.85%～102.13%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。該方法操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以為何首烏藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供方法參考。

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收稿日期：2015-09-13;修回日期：2015-11-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI13B04)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2014)資助

作者簡(jiǎn)介：羅益遠(yuǎn)(1989—)，男(漢族)，福建連城人，碩士研究生，從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail: luoyiyuan0012@sohu.com 通信作者：劉訓(xùn)紅(1959—)，男(漢族)，江蘇濱海人，教授，從事中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail: liuxunh1959@sohu.com

中圖分類號(hào)：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2997(2016)04-0327-09

doi：10.7538/zpxb.youxian.2016.0016

Simultaneous Determination of Stilbenes, Anthraquinones,Flavonoids and Phenolic Acids inPolygoniMultifloriRadix by UPLC-MS/MS

LUO Yi-yuan1, LIU Juan-xiu1, LIU Ting1, LIU Xun-hong1,LAN Cai-wu2, WANG Sheng-nan1, HUA Yu-jiao1

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.GuizhouChangHaoChineseMedicineCo.,Ltd.,Kaili556000,China)

Abstract:A comprehensive analytical method based on UPLC-MS/MS was developed for the simultaneous determination of fourteen components include three stilbenes (stilbeneglucoside, polydatin, resveratrol), five anthraquinones (emodin, physcion, emodin-8-β-D-glucopyranoside, aloe-emodin, rhein), five flavonoids (epicatechin, quercetin, rutin, astragalin, hyperoside), and one phenolic acid (gallic acid) in Polygoni Multi-flori Radix. The samples was extracted with 70% methanol water solutions and assisted by ultrasonic machine. The extraction conditions which were optimized by experiment as following: the solid liquid ratio was 1∶25, the extraction time was 45 min at room temperature, the extractant phase was separated by centrifugation at 12 000 r/min for 10 min, then filtered through 0.22 μm nylon membranes. Under the optimized chromatographic conditions, good separation for fourteen target compounds were obtained on a Waters BEH C18 (100 mm×2.1 mm×1.7 μm) eluted by a mobile phase of water (0.1% acetic acid, A)-acetonitrile (B) at a flow rate of 0.25 mL/min. The target compounds were analyzed by multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that fourteen components have good linearity, the linearity of the detected components is excellent more than 0.991 5, and the limits of detection are all satisfied. The average recoveries of standard addition for the compounds are between 95.85% and 102.13%, and the relative standard deviations are less than 5%. The established method is simplify, sensitive and accurate, which is suitable for determination of fourteen components in Polygoni Multiflori Radix, and also can provide a reliable and effective technique for the quality control of Polygoni Multiflori Radix.

Key words：Polygoni Multiflori Radix; UPLC-MS/MS; stilbenes; anthraquinones; flavonoids; phenolic acid

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-28；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.014.html