王宏偉 徐燕 李海龍 陳鳳琴 吳紅彥
摘要:目的 觀察黃芩苷對胃癌BGC-823、MGC-803細胞遷移的影響,探討其可能的作用機制。方法 劃痕實驗和Transwell小室觀察Toll樣受體(TLR)激活后以及黃芩苷干預TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803細胞遷移能力;RT-qPCR和Western blot檢測胃癌BGC-823、MGC-803細胞的TLR4、激活蛋白-1(AP-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA和蛋白表達。結(jié)果 脂多糖(LPS)可促進胃癌BGC-823、MGC-803細胞遷移,黃芩苷可抑制LPS干預后胃癌BGC-823、MGC-803細胞遷移;LPS可上調(diào)TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達,黃芩苷可下調(diào)LPS干預后胃癌BGC-823、MGC-803細胞的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達。結(jié)論 黃芩苷可阻斷TLR4-AP-1-VEGF的激活,從而抑制胃癌BGC-823、MGC-803細胞的遷移。
關(guān)鍵詞:脂多糖;Toll樣受體;黃芩苷;遷移;胃癌
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.017
中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)08-0064-05
炎癥與腫瘤關(guān)系密切,慢性炎癥與25%以上癌癥的發(fā)生相關(guān),參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。胃癌的發(fā)生與慢性炎癥密切相關(guān),“Hp感染-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生-胃癌”是典型的炎癥與癌癥相關(guān)的例子。尋找一種既抗炎又抗腫瘤的藥物是抗腫瘤研究的重要方向。黃芩苷是唇形科
植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。研究表明,黃芩苷有抗腫瘤[2]、抑菌抗炎[3]等藥理作用。脂多糖(LPS)是Toll樣受體(TLR)的外源性配體,能激活TLR的核因子(NF)-κB及激活蛋白-1(AP-1)等信號通路,引起多種細胞的炎癥反應(yīng)[4]。本實驗采用LPS干預胃癌BGC-823、MGC-803細胞激活TLR,觀察LPS對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響,并用黃芩苷加以干預,觀察黃芩苷對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,初步探討其可能的作用機制,為黃芩苷治療炎癥相關(guān)性腫瘤提供實驗依據(jù)。
1 實驗材料
1.1 細胞株
胃癌MGC-803、BGC-823細胞,中國科學院上海生命科學研究院。
1.2 藥物與試劑
黃芩苷,南京狄爾格醫(yī)療器械有限公司,CAS號21967-41-9。高糖DMED培養(yǎng)基,健順生物公司;胎牛血清(FBS),杭州四季青公司;Maker和Transwell小室,Thermo scientific公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒,大連寶生物公司,引物均由大連寶生物公司合成;一抗TLR4、AP-1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自Affinity公司,二抗購自碧云天公司。
1.3 主要儀器
光學顯微鏡(日本Nikon公司),超凈工作臺(蘇靜安泰),CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司),微量移液槍(日本立洋),TGL-16G離心機(上海醫(yī)療器械七廠),低溫離心機(Beckman公司),電泳儀(北京六一儀器廠),微量上樣器(上海生工生物工程有限公司)。
2 實驗方法
2.1 細胞培養(yǎng)
用含10%FBS高糖DMEM,加青霉素、鏈霉素(100 U/mL),37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)胃癌MGC-803、BGC-823細胞。每隔2 d換完全培養(yǎng)基,待細胞密度達90%時按1∶2比例傳代。取對數(shù)生長期細胞用于下一步實驗。
2.2 劃痕實驗
將對數(shù)生長期細胞接種于預先底部畫線的6孔板,待細胞貼壁生長至滿,用10 μL無菌槍頭垂直于底部劃線性劃痕,PBS漂洗3次去除脫落細胞,再用無血清培養(yǎng)液[分為對照組(只加培養(yǎng)液)、LPS組(1、10、100、1000、10 000 ng/mL)、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組]干預,繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后0、12、24、36 h隨機選擇劃痕區(qū)3個視野拍照,比較各組間劃痕愈合的差異,用愈合率代表細胞遷移能力。計算細胞愈合率[(愈合前細胞間空白區(qū)域面積-愈合后細胞間空白區(qū)域面積)÷愈合前細胞間空白區(qū)域面積×100%]。
2.3 Transwell小室實驗
將對數(shù)生長期細胞饑餓12 h后,按5×105個/mL細胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Transwell小室中,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞貼壁后,吸出小室中培養(yǎng)液,換新的無血清培養(yǎng)基[分為對照組(只加培養(yǎng)液)、LPS組(1000 ng/mL)、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組]繼續(xù)培養(yǎng),在下室中加600 μL含25%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,經(jīng)PBS洗滌,甲醛固定,甲醇滲透,結(jié)晶紫染色后鏡下選3個視野拍照計數(shù),取其平均值,以穿過小室細胞數(shù)代表細胞的遷移能力。
2.4 RT-qPCR檢測
將對數(shù)生長期胃癌MGC-803、BGC-823細胞分為對照組(只加培養(yǎng)液)、LPS組(1000 ng/mL)、黃芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL組,干預24 h,提取各組總RNA,37 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃反轉(zhuǎn)錄成cDNA;95 ℃、10 min,95 ℃、15 s,60 ℃、30 s,65 ℃、30 s,經(jīng)過40個循環(huán),cDNA擴增,檢測TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線,從而判定擴增產(chǎn)物是否有非特異性擴增;分析擴增曲線,計算Ct值,采用2?ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。
2.5 Western blot檢測
將對數(shù)生長期胃癌MGC-803、BGC-823細胞分為對照組(只加培養(yǎng)液)、LPS組(1000 ng/mL)、黃芩苷(40 μmol/L)+LPS(1000 ng/mL)組干預24 h,加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取總蛋白,將蛋白煮沸變性后,經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1.5 h,一抗(TLR4、AP-1、VEGF、GAPDH)孵育過夜,TBST洗膜3次,二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進行反應(yīng),采用Image J軟件對Western blot結(jié)果進行定量分析,灰度值以累積吸光度值表示,結(jié)果以目的蛋白與GAPDH累積吸光度的比值表示。
3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計意義。
4 結(jié)果
4.1 劃痕實驗黃芩苷對胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移能力的影響
與對照組比較,LPS組劃痕愈合程度明顯高于對照組,并隨濃度的增大,愈合程度也逐漸增強,其中,1000 ng/mL LPS組愈合程度最強,24 h時效果最明顯,見圖1、圖2。根據(jù)以上結(jié)果,選用1000 ng/mL LPS作為LPS組。根據(jù)前期實驗MTT結(jié)果,選用40 μmol/L黃芩苷干預作為黃芩組。繼續(xù)用劃痕實驗觀察黃芩苷對LPS干預后2株胃癌細胞遷移能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS+黃芩苷組較LPS組愈合程度慢,差異有統(tǒng)計意義(P<0.01),見圖3、圖4。
4.2 Transwell實驗黃芩苷對胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移能力的影響
選用1000 ng/mL LPS作為LPS組,選用40 μmol/L黃芩苷干預作為黃芩苷組,繼續(xù)用Transwell實驗觀察黃芩苷對胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移能力的影響。與對照組比較,LPS組2株細胞穿過小室細胞數(shù)較多(P<0.01);與LPS組比較,LPS+黃芩苷組穿過小室細胞數(shù)較少(P<0.01),見圖5、圖6。
4.3 黃芩苷對Toll樣受體4、激活蛋白-1、血管內(nèi)皮生長因子基因表達的影響
與對照組比較,LPS組TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達明顯升高(P<0.01);與LPS組比較,LPS+黃芩苷組TLR4、AP-1、VEGF mRNA表達明顯降低(P<0.01)。結(jié)果見圖7、圖8。
4.4 黃芩苷對Toll樣受體4、激活蛋白-1、血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達的影響
與對照組比較,LPS組TLR4、AP-1、VEGF蛋白表達明顯升高(P<0.01);與LPS組比較,LPS+黃芩苷組TLR4、AP-1、VEGF蛋白表達顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖9、圖10。
5 討論
近年來大量的實驗表明,炎癥不僅與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),與腫瘤轉(zhuǎn)移也密切相關(guān),在這個領(lǐng)域目前已取得一些初步成果,如versican-TLR2-TNFα、RANKL-RANK-IKKFα-Maspin通路等[5]。
目前中藥成分抗腫瘤的研究已成為熱點。杜氏等[6]報道雷公藤紅素抑制HepG2細胞的遷移,朱氏等[7]研究痰瘀同治方藥物血清有影響人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和遷移的作用。我們的前期實驗也發(fā)現(xiàn),黃芩苷可通過死亡受體通路誘導胃癌細胞凋亡。同時有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制結(jié)腸癌細胞的遷移[8]。
LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分,在慢性炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本實驗目的在于用LPS營造一個腫瘤的炎性微環(huán)境,觀察LPS是否促進胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移以及黃芩苷是否抑制炎性微環(huán)境胃癌細胞的遷移。本研究通過劃痕實驗及Transwell小室實驗證實了LPS可促進以上2株胃癌細胞的遷移,且發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制LPS干預的胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移。研究發(fā)現(xiàn),LPS與TLR4結(jié)合后可誘導肺癌細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子、VEGF及白細胞介素-8,同時LPS可使肺癌細胞的VEGF表達升高,促進肺癌細胞的轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果也證實了這一點。
Qian等[10]研究顯示,LPS可激活膀胱癌細胞的TLR4 信號轉(zhuǎn)導通路,激活MAPK。Ouyang等[11]進一步研究表明,MAPK可激活AP-1,AP-1以由c-Jun、c-Fos和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域形成的異源二聚體的形式存在于細胞中,在腫瘤的發(fā)生和演進過程中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用,且VEGF基因啟動子中含有多個AP-1結(jié)合位點,活化的AP-1可以通過VEGF促使腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。因此,可以認為LPS激活腫瘤細胞的TLR4信號轉(zhuǎn)導通路,激活MAPK,從而激活AP-1,最終激活VEGF,導致腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。
Feng等[12]研究顯示,黃芩苷可下調(diào)TLR4表達。本研究發(fā)現(xiàn),LPS干預的2株胃癌細胞TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達均明顯升高,而黃芩苷可下調(diào)LPS干預后的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表達。由此可以認為,黃芩苷可能通過抑制LPS與TLR4的結(jié)合,從而抑制MAPK激活AP-1,抑制VEGF表達,進而抑制2株胃癌細胞的遷移。
本實驗只觀察LPS及黃芩苷對胃癌MGC-803、BGC-823細胞遷移的影響及可能的作用機制,其對2株胃癌細胞侵襲的影響尚未可知,需進行更多的實驗觀察驗證。
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