王文瀟 衛(wèi)東鋒 張占軍 程衛(wèi)東

摘要：目的 觀察黃芩素對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠發(fā)病早期認(rèn)知功能和皮層、海馬組織蛋白表達(dá)譜的影響，探討其作用機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、黃芩素組，每組12只。黃芩素組大鼠予黃芩素藥液灌胃，模型組和對照組大鼠予等量生理鹽水灌胃。灌胃體積均為2 mL，連續(xù)10 d。利用Morris水迷宮評估治療效果，并運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)對腦組織蛋白進(jìn)行分離，考馬斯藍(lán)染顯色，應(yīng)用PDQuest8.0軟件對雙向電泳圖譜進(jìn)行差異分析，通過MALDI-TOF-MS/MS和數(shù)據(jù)庫查詢鑒定差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并利用String在線分析軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 黃芩素可顯著緩解β-淀粉樣蛋白（Aβ）1-40導(dǎo)致的認(rèn)知功能減退。黃芩素作用下，位于大鼠大腦皮層和海馬組織的8種蛋白表達(dá)水平變化明顯。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，差異蛋白涉及4種生物學(xué)功能，與神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)系最為密切，其中3種蛋白與其他蛋白存在相互作用關(guān)系。結(jié)論 黃芩素對AD大鼠早期認(rèn)知功能損傷的改善作用與其能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病；β-淀粉樣蛋白；黃芩素；神經(jīng)傳導(dǎo)；蛋白組學(xué)；學(xué)習(xí)記憶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.016

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0059-05

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種危害老年人健康、影響老年人生活質(zhì)量的神經(jīng)退行性疾病。自20世紀(jì)90年代起我國步入老齡化社會，AD發(fā)病率逐年增高[1]。其主要臨床表現(xiàn)為記憶下降與認(rèn)知功能障礙，病理學(xué)表現(xiàn)有腦細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的神經(jīng)炎性斑（neuritic plaques，NP）與腦細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）[2]。目前，由于AD病因不明，現(xiàn)有西藥只能緩解癥狀而不能針對病因進(jìn)行治療，新藥的研發(fā)又處于瓶頸期難以突破。藥用植物學(xué)逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。因此，從傳統(tǒng)中草藥中尋找對AD有療效的活性單體是一項(xiàng)具有廣闊前景與實(shí)際意義的工作。黃芩（Radix Scutellariae）為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。《神農(nóng)本草經(jīng)》載黃芩有“諸熱黃膽，腸泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩不僅有傳統(tǒng)的抗菌、抗炎等功效，還可作用于神經(jīng)系統(tǒng)。黃芩水提物對腦出血大鼠血腦屏障損傷有一定的治療和保護(hù)作用[3]。黃芩中具有生物活性的黃酮類物質(zhì)黃芩素可通過抗細(xì)胞凋亡、抗氧化等機(jī)制起到神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在利用蛋白組學(xué)技術(shù)對比黃芩素治療前后AD模型大鼠腦組織皮層及海馬組織蛋白表達(dá)譜的差異，利用雙向凝膠電泳（2-DE）、MALDI-TOF-MS/MS、數(shù)據(jù)庫查詢和生物信息學(xué)分析技術(shù)研究由Aβ1-40和黃芩素治療所導(dǎo)致的大鼠大腦皮層和海馬的差異蛋白，從亞細(xì)胞蛋白水平尋找證據(jù)，為黃芩素作為治療AD的臨床藥物提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

黃芩素，瑞士Fluka Bio Chemika公司，溶于生理鹽水，用NaOH溶液將pH值調(diào)至10。

1.2 動(dòng)物

雄性SPF級SD大鼠36只，4月齡，體質(zhì)量250～300 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0015。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，人工光照時(shí)間為明暗各12 h。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ1-40，美國Sigma-Aldrich公司，實(shí)驗(yàn)前將其用無菌生理鹽水稀釋至10 mg/mL，4 ℃孵育48 h至Aβ1-40多聚體，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.25%TrypsinEDTA（美國Gibco公司），六氟異丙醇[阿拉丁試劑（中國）有限公司]；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）。IPG緩沖液、蛋白酶抑制劑，美國Sigma公司；Morris水迷宮DMS-3，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所；CLASS100型超凈工作臺，珠海造鑫企業(yè)有限公司；MilliQ超純水系統(tǒng)，Millipore公司；IX71型倒置熒光相差顯微鏡、BX-60型倒置熒光相差顯微鏡數(shù)碼相機(jī)，日本Olympus公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝公司；ELX80酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；1/1000A2005型精密電子天平，德國Saitorius公司；5415D型低溫高速多功能離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、黃芩素組，每組12只。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[5]方法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，麻醉后利用腦立體定向儀固定大鼠頭部，分離骨膜暴露頭骨，按照大鼠腦立體定位圖譜，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，用牙科鉆打開顱骨，用5 μL微量進(jìn)樣器顯微注射，5 min內(nèi)緩慢勻速注入4 μL Aβ1-40多聚體并留針5 min，縫合傷口。

2.3 給藥

造模后4 d開始灌胃給藥，參照文獻(xiàn)[6-7]及前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，黃芩素組每日予黃芩素80 mg/kg灌胃，模型組和對照組每日予等量生理鹽水灌胃。灌胃體積均為2 mL，連續(xù)10 d。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

造模給藥結(jié)束后，應(yīng)用Morris水迷宮對大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行評價(jià)。水迷宮直徑150 cm，高50 cm，恒溫23 ℃。水池被平均分為4個(gè)象限，在其中一個(gè)象限中央放置距離水面2 cm、直徑15 cm的圓形平臺。正式測試前進(jìn)行連續(xù)5 d的可視平臺實(shí)驗(yàn)，平臺位于目標(biāo)象限并使其頂部高于水面2 cm，記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期和總路線。再進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)象限為第三象限，平臺位于水面下2 cm，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，大鼠從除目標(biāo)象限外的任一點(diǎn)入水，測定大鼠找到平臺的逃避潛伏期和搜索距離。

2.5 雙向凝膠電泳

2.5.1 蛋白質(zhì)樣品制備與純化 水迷宮測試結(jié)束后，將各組大鼠斷頭處死，冰上去除顱骨后，迅速取出腦組織，分離出皮層及海馬組織，精確稱重。將各組大鼠皮層和海馬組織放入組織勻漿器中，加1.5 mL雙向電泳組織裂解液[含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、65 mmol/L DTT和0.5%（V/V）Bio-Lyte，pH 3～10]，勻漿處理，冰上靜置裂解20 min，液氮反復(fù)凍融3次，加RNase 50 ?g/mL、DNase 200 ?g/mL，4 ℃放置10 min，冰水混合物中進(jìn)行超聲破碎（100 W，工作3 s，間歇2 s，15個(gè)循環(huán)），8000 r/min離心10 min×2次，去除未溶解雜質(zhì)，再以12 000 r/min離心10 min，吸取上清液即為總蛋白溶液。采用Bradford法測定提取的蛋白質(zhì)濃度，分裝后-70 ℃冰箱貯存?zhèn)溆没蛑苯佑糜陔p向電泳。

2.5.2 雙向電泳 2-DE參照Bio-Rad雙向電泳指南進(jìn)行，沿聚焦盤邊緣緩慢加入300 μL含1 mg蛋白質(zhì)樣品的水化上樣緩沖液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5%兩性電解質(zhì)，0.001%溴酚藍(lán)），將膠條膠面朝下放入聚焦槽內(nèi)，并覆蓋2 mL礦物油，設(shè)置程序后進(jìn)行第一向等電聚焦。待膠條平衡30 min后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

2.5.3 凝膠圖像分析 應(yīng)用透射掃描儀對凝膠掃描獲取凝膠圖像，以對照組為參考膠，采用PDQuest8.0圖像分析軟件對凝膠圖譜依次進(jìn)行點(diǎn)檢測、背景消減、標(biāo)準(zhǔn)化、匹配、建立平均凝膠，結(jié)合人工校正進(jìn)行凝膠圖像分析。選取圖譜中蛋白點(diǎn)體積相對變化量大于2倍且P<0.05的蛋白點(diǎn)作為差異蛋白點(diǎn)。

2.6 差異蛋白質(zhì)譜分析

將凝膠上差異明顯的10個(gè)蛋白點(diǎn)通過切膠、脫色、酶解、萃取等操作制備蛋白樣品。將樣品放入API4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀MALDI-TOF-MS/MS中分析，采用正離子模式和自動(dòng)獲取模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，選擇強(qiáng)度最大的10個(gè)峰進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定，得到PMF指紋圖譜。應(yīng)用GPS3.6和Mascot2.1軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和蛋白鑒定。

2.7 差異表達(dá)蛋白相互作用圖譜分析

將差異明顯8個(gè)蛋白上傳至String9.05蛋白-蛋白相互作用關(guān)系在線分析軟件（http：//www.string-db.org），通過調(diào)節(jié)可信度和附加節(jié)點(diǎn)參數(shù)，獲得差異表達(dá)蛋白的相互作用圖譜，篩選中心節(jié)點(diǎn)蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，方差齊性者采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果

水迷宮定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠第4日逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，黃芩素組第4日逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？梢暺脚_實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠逃避潛伏期無明顯變化（P>0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 大腦皮層和海馬組織蛋白雙向凝膠電泳圖譜分析結(jié)果

各組均進(jìn)行了2-DE凝膠分析，并用考馬斯亮藍(lán)G-250染色增加凝膠圖像質(zhì)量，模型組與黃芩素組差異蛋白體積至少相差2倍且P<0.05才被認(rèn)為差異表達(dá)明顯，見圖1。

4.3 雙向凝膠電泳圖譜差異蛋白點(diǎn)分析結(jié)果

模型組和黃芩素組大腦皮層與海馬組織蛋白的2-DE圖譜經(jīng)PDQuest軟件分析，將2組差異明顯的3個(gè)蛋白點(diǎn)2-DE圖譜放大顯示，見圖2。

4.4 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

選取其中差異較為明顯的可能為關(guān)鍵功能蛋白的10個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，共有8個(gè)蛋白得到成功鑒定，見表2。差異蛋白涉及4種生物學(xué)功能，其中與神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)系最為密切，還與其他功能如抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等相關(guān)。

4.5 差異表達(dá)蛋白相互作用結(jié)果

String9.05蛋白相互作用分析結(jié)果表明，翻譯控制腫瘤蛋白（Tpt1），Rab GDP解離抑制因子α（Gdi1），復(fù)合素-1（Cplx1）與其他蛋白存在相互作用關(guān)系，見圖3。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中包含2個(gè)子網(wǎng)絡(luò)，分別與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、抗細(xì)胞凋亡相關(guān)。但β-突觸核蛋白（Sncb）、鈣網(wǎng)蛋白（Calb2）、硫氧還蛋白-1（Txnl1）等與其他蛋白并不存在相互作用關(guān)系。

5 討論

AD是老年期最常見的癡呆類型，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前FDA批準(zhǔn)AD治療藥物主要有膽堿酯酶抑制劑安理申和NMDA受體非競爭性拮抗劑美金剛，但其不能阻止疾病進(jìn)展，也無法恢復(fù)已受損的認(rèn)知功能。黃芩作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥在臨床常被用于治療中風(fēng)、感染性疾病、高血壓等疾病[8]。黃芩素是其中最主要的類黃酮提取物之一，已有研究表明，黃芩素可通過抑制氧化應(yīng)激來減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)減少對超氧化物歧化酶、丙二醛的激活來減輕Aβ25-35導(dǎo)致的神經(jīng)病理學(xué)改變和認(rèn)知功能損傷[9-10]。

AD發(fā)病機(jī)制的主流觀點(diǎn)是具有神經(jīng)毒性的Aβ1-40沉積于腦內(nèi)引起腦損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)利用Aβ1-40制備具有AD病理學(xué)特征的大鼠模型。利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評估造模是否成功、黃芩素的治療效果，發(fā)現(xiàn)Aβ對大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶功能的損傷較大，黃芩素可顯著改善這種損傷。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白組學(xué)研究方法成功鑒定出黃芩素治療AD大鼠模型大腦皮質(zhì)和海馬組織8種蛋白表達(dá)上調(diào)，是黃芩素預(yù)防和治療AD的直接靶標(biāo)。

本研究驗(yàn)證的蛋白可能與以下機(jī)制相關(guān)：Gdi1主要通過調(diào)節(jié)Rab小G蛋白的神經(jīng)遞質(zhì)釋放起到神經(jīng)保護(hù)作用[11]。Sncb上調(diào)可通過抑制α-Synuclein聚集改善神經(jīng)元變性，緩解神經(jīng)退行性病變[12]。黃芩素上調(diào)Calb2可能作為載體蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶使淀粉樣蛋白保持溶解狀態(tài)，從根源上減少Aβ沉積[13-14]。Trx-1作為體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，可通過清除過量氧自由基，修復(fù)過氧化的巰基蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，抑制細(xì)胞凋亡以及調(diào)控胞內(nèi)氧化還原平衡，發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用[15]。Cplx1是突觸前結(jié)構(gòu)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)蛋白，Tannenberg等[16]發(fā)現(xiàn)AD患者腦中Cplx1顯著下降，Cplx1的治療機(jī)制可能與改變突觸可塑性有關(guān)[17]。Tpt1在癌細(xì)胞和其他分裂活躍細(xì)胞中表達(dá)水平較高[18]，而在腦等停止分裂的組織中低表達(dá)[19]。以往研究在對AD死者尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些區(qū)域的腦細(xì)胞中翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）水平下降，細(xì)胞凋亡增加，故黃芩素可能是通過上調(diào)TCTP發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用保護(hù)神經(jīng)元。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用蛋白組學(xué)研究方法檢測黃芩素治療AD大鼠模型大腦皮質(zhì)和海馬組織蛋白，發(fā)現(xiàn)黃芩素可上調(diào)神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的靶蛋白，作用機(jī)制可能與神經(jīng)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞骨架等有關(guān)。但黃芩素對AD治療作用及其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，以深入探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為黃芩素作為AD治療藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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