高堂珂,步青云,高楊,王鑫,高譽珊,毛穎秋,薛衛(wèi)國(北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

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電針對7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠行為學及海馬微血管壁Ab沉積影響的研究

高堂珂,步青云,高楊,王鑫,高譽珊,毛穎秋,薛衛(wèi)國
(北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

【摘要】目的通過觀察電針對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬微血管壁Ab沉積及學習記憶能力的影響,探討電針治療阿爾茨海默病(AD)的一種作用機制,即改善Ab的腦微血管清除途徑。方法將24只7月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠隨機分為模型組、電針治療組,各12只,以同窩同性別的轉(zhuǎn)基因陰性小鼠(12只)為空白對照組。電針治療組電針百會、涌泉,每次15 min,隔日1次,共6星期。治療后,以Morris水迷宮檢測小鼠空間學習記憶能力,以免疫組化法檢測Ab1-40、Ab1-42在海馬腦微血管壁和老年斑的表達,使用Imagine Pro Plus軟件對海馬腦微血管壁Ab的陽性表達進行半定量分析。結(jié)果Morries水迷宮結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型組逃避潛伏時延長(P＜0.05);穿越平臺次數(shù)及平臺象限內(nèi)游泳時間均減少(P＜0.05)。與模型組相比,電針治療組逃避潛伏時變短(P＜0.05),穿越平臺次數(shù)和平臺象限內(nèi)游泳時間均增加(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,模型組海馬微血管壁Ab1-42、Ab1-40積分光密度均高于空白對照組(P＜0.05),且海馬內(nèi)出現(xiàn)老年斑。電針治療組海馬微血管壁Ab1-42、Ab1-40積分光密度均低于模型組(P＜0.05)。結(jié)論電針改善了小鼠學習記憶損害,減輕了海馬微血管壁Ab沉積,其機制可能是通過改善Ab的腦微血管清除途徑,從而降低腦內(nèi)Ab沉積實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】電針;阿爾茨海默病;海馬微血管壁;b淀粉樣蛋白;APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。Ab級聯(lián)學說為當下最為認可的AD發(fā)病機制,即b-淀粉樣蛋白腦內(nèi)生成、聚集、沉積形成淀粉樣斑塊(老年斑),并產(chǎn)生神經(jīng)毒性造成患者腦內(nèi)的一系列病理學變化和臨床癥狀[1]。

腦內(nèi)Ab主要以兩種結(jié)構(gòu)形式存在,Ab1-40和Ab1-42,其在腦內(nèi)過量沉積會造成認知功能損害[2-3]。正常狀態(tài)下Ab在腦內(nèi)的產(chǎn)生和清除之間存在著動態(tài)平衡,Ab可從腦實質(zhì)內(nèi)(brain interstitial fluid, ISF)不斷地被清除,而在腦內(nèi)保持正常水平不會出現(xiàn)神經(jīng)毒性。

研究表明占AD發(fā)病95%左右的晚發(fā)性AD患者是以腦內(nèi)Ab清除異常為主。近年來,在Ab的多種清除途徑中,由于腦血管淀粉樣變與AD病理變化間千絲萬縷的聯(lián)系,Ab的腦血管清除途徑成為目前的研究熱點[4-5]。在腦血管清除途徑中,Ab可通過腦微血管的一種飽和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(saturable efflux system)進行大量快速的轉(zhuǎn)運,即跨血腦屏障轉(zhuǎn)運[6]。因此腦微血管血腦屏障成為Ab腦血管清除途徑機制研究的靶點[7-8]。在動物實驗中,若腦微血管清除Ab的功能出現(xiàn)障礙,Ab將會沉積于腦微血管壁,并進一步破壞腦微血管Ab清除途徑,導致腦內(nèi)Ab水平升高、沉積、聚集,并在腦實質(zhì)內(nèi)生成淀粉樣斑塊(老年斑),產(chǎn)生神經(jīng)毒性導致學習記憶能力的下降[9]。因此腦微血管壁的Ab沉積現(xiàn)象是Ab腦微血管清除途徑障礙的重要指標。

本研究團隊在過去實驗中發(fā)現(xiàn)電針百會、涌泉能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能障礙,并使用elise檢測到其腦內(nèi)Ab水平降低[10]。故猜測電針對AD的治療機制可能是通過改善Ab的腦微血管清除途徑,使腦內(nèi)Ab水平降低實現(xiàn)的。因此本實驗將觀察電針百會、涌泉穴對AD小鼠模型學習記憶能力和海馬腦微血管壁Ab1-40、Ab1-42沉積現(xiàn)象的影響,探討電針治療AD的一種作用機制,即改善Ab的腦微血管清除途徑。

1　材料與方法

1.1動物模型分組及干預方法

選取24只6月齡健康的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠為AD動物模型,隨機分為模型組12只、電針治療組12只。以同窩同月齡的轉(zhuǎn)基因陰性鼠12只作為空白對照組。所有動物全部從南京大學模式動物研究所購入。批號為SCXK(寧)2010-000。體重(33.20±3.87)g。實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

電針治療組,將該組小鼠俯臥位固定于自制鼠板上(見圖1),對比動物解剖及針灸圖譜,兩耳尖的中點取百會,在足底前、中1/3交界處取涌泉。針刺百會,電針雙側(cè)涌泉穴,平刺2～3 mm,采用疏密波,頻率1/50 Hz,強度0.1 mA,電針強度以針柄微微顫動、小鼠不嘶叫掙扎為度。每次電針治療15 min,隔日1次,共治療6星期。模型組、正常對照組以相同方法用自制鼠袋束縛15 min,隔日1次,共束縛6星期。

圖1　電針治療方法與自制鼠袋束縛方法

1.2主要試劑和儀器

Ab1-42兔多克隆抗體(美國Abcam,貨號ab10148); Ab1-40兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號bs-0877R);免疫組化超敏試劑盒(兔)(邁新生物科技,批號KIT-9706;一次性使用無菌針灸針(0.25 mm ×13 mm,中研太和牌);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司,HANs LH202H型);Morris水迷宮(BS-124S Morris型水迷宮,由北京中醫(yī)藥大學附屬東直門中醫(yī)院中藥藥理學實驗室提供,視頻分析系統(tǒng)為上海移動信息科技有限公司生產(chǎn))等。

1.3學習記憶能力檢測方法

以Morries水迷宮作為行為學檢測的實驗裝置,在小鼠治療6星期后開始進行水迷宮實驗。水池共分為4個象限。水池第三象限內(nèi)放一圓形平臺,水面高出平臺1 cm。水池內(nèi)水溫保持在(22±2)℃。實驗前將各組小鼠置于平臺上10 s以熟悉周圍環(huán)境。第1、2、3、4天進行定位航行實驗,依次按1、2、3、4象限的順序?qū)⑿∈竺姹苤萌氤刂?。小鼠登上平臺5 s后停止計時,若未登上平臺則按60 s計,記錄4個象限小鼠放入池中到登上平臺后所需要的時間,取其平均值為定位航行實驗的逃避潛伏時。第5天進行空間探索實驗,即撤去平臺,直接將小鼠按1、2、3、4象限順序依次放入池中,記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺位置的次數(shù)和在第3象限游泳時間。最后以逃避潛伏時,穿越平臺次數(shù)和第3象限游泳時間作為評判小鼠學習記憶能力指標。

1.4腦組織取材及Ab1-42和Ab1-40免疫組化實驗方法

每組隨機取6只小鼠,以10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后以肝素化生理鹽水和多聚甲醛各40 mL經(jīng)左心室快速灌注,待小鼠尾部翹起后,開顱取腦,放入4%多聚甲醛中固定24 h。

取固定好的大腦,流水沖洗后修塊,石蠟包埋,從視交叉處開始向后行片厚6mm的冠狀切片,選取海馬結(jié)構(gòu)完整且呈水平位的切片進行Ab1-42、Ab1-40免疫組化ABC法檢測。免疫組化染色的具體步驟為切片脫蠟水化;0.3%甲醇雙氧水室溫10 min;0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原10 min;15%正常羊血清37℃室溫下封閉30 min;滴加一抗Ab1-42、Ab1-40抗體(均以1:100稀釋),4℃,36 h;PBS洗;生物素化二抗37℃,90 min;PBS洗;AB復合物37℃,90 min;PBS洗; DAB顯色;脫水、透明、封片。以PBS取代一抗作為陰性對照。使用Leica系統(tǒng)相連接的DXM1200相機采集切片圖像。

本次半定量共18只小鼠,取每只小鼠1張染色后切片,使用Leica圖像采集系統(tǒng),在400倍放大下采集小鼠海馬內(nèi)3個視野拍照,采集圖片后,利用Imagine Pro Plus軟件圈出圖片內(nèi)腦微血管,計算出每張圖片腦微血管壁Ab積分光密度總和,取每只動物所有圖片微血管壁Ab積分光密度的平均數(shù),用此數(shù)據(jù)表示Ab1-40和Ab1-42在每只動物腦微血管壁的表達強度,并進行統(tǒng)計學分析。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。Morries水迷宮實驗逃避潛伏期、穿越目標象限次數(shù)、第3象限游泳時間計算平均值后保存小數(shù)點后兩位[11]。分析觀察電針治療組、模型組、空白對照組3組間逃避潛伏期在Morries水迷宮實驗1～4天的變化,該數(shù)據(jù)產(chǎn)生條件符合被試對象在接受不同處理后,對同一因變量(即測試指標)在不同時間點上進行多次測量所得資料(重復測量資料),故采用多組重復測量設(shè)計資料方差分析(ANOVA)[12]。穿越目標象限次數(shù)、第3象限游泳時間、Ab1-40和Ab1-42積分光密度采用單因素方差分析(one-way ANOVA),使用LSD檢驗對各組件進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Morries水迷宮行為學檢測結(jié)果

從表1中可知,隨著訓練天數(shù)的增加,各組逃避潛伏時不斷減少。多組重復測量設(shè)計資料方差分析可知,3組逃避潛伏時組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組逃避潛伏時長于空白對照組(P＜0.05)。電針治療組逃避潛伏時短于模型組(P＜0.05)。

表1　各組小鼠Morries水迷宮逃避潛伏時比較(±s,s)

表1　各組小鼠Morries水迷宮逃避潛伏時比較(±s,s)

注:與空白對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與同組第1天比較3)P＜0.05

組別　n　第1天　第2天　第3天　第4天空白對照組　12　58.87±2.78　58.17±3.99 54.70±6.06　52.60±7.443)模型組　12　59.93±0.38　60.04±0.00 59.07±1.621)59.01±1.953)電針治療組　12　59.81±0.59　59.26±2.69 56.12±6.072)53.15±6.273)

根據(jù)穿越平臺次數(shù)和平臺象限內(nèi)游泳時間單因素ANOVA分析結(jié)果可知,各組間兩項指標均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。模型組穿越平臺次數(shù)及第3象限游泳時間均低于空白對照組(P＜0.05)。電針治療組穿越平臺次數(shù)及第3象限內(nèi)游泳時間均高于模型組(P＜0.05)。詳見表2。

表2　各組小鼠Morries水迷宮空間探索實驗第4象限入水點穿越平臺次數(shù),第3象限游泳時間比較　(±s)

表2　各組小鼠Morries水迷宮空間探索實驗第4象限入水點穿越平臺次數(shù),第3象限游泳時間比較　(±s)

注:與空白對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別　n　穿越平臺位置次數(shù)(次)平臺象限游泳時間(s)空白對照組　12　1.45±0.97　14.19±5.21模型組　12　0.49±0.631)　8.24±3.731)電針治療組　12　0.90±0.512)　11.33±3.192)

2.2Ab免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1各組海馬腦微血管壁Ab1-42及其老年斑表達情況

圖2所示,Ab1-42主要在海馬微血管壁,錐體細胞、顆粒細胞及老年斑內(nèi)呈陽性表達。模型組海馬內(nèi)可見老年斑,老年斑呈核心致密型。老年斑鄰近的腦微血管壁Ab陽性表達更加明顯;電針治療組海馬微血管壁Ab1-42陽性表達較模型組弱,且老年斑數(shù)量和面積少于模型組。空白對照組海馬內(nèi)未見老年斑出現(xiàn),腦微血管壁周圍Ab1-42僅有極其微弱的陽性表達。

由表3可知,各組間海馬腦微血管壁Ab1-42積分光密度IOD具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。模型組海馬腦微血管壁IOD大于空白對照組(P＜0.05),電針治療組海馬腦微血管壁IOD小于模型組(P＜0.05)。

表3　各組小鼠海馬腦微血管壁Ab1-42積分光密度(IOD)比較(±s)

表3　各組小鼠海馬腦微血管壁Ab1-42積分光密度(IOD)比較(±s)

注:與空白對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別　n　海馬腦微血管壁Ab1-42IOD空白對照組　6　1295.39±731.21模型組　6　2518.72±1056.891)電針治療組　6　1515.12±983.442)

2.2.2各組海馬腦微血管壁Ab1-40及其老年斑表達情況

圖3所示,Ab1-40在海馬微血管壁表達最明顯,錐體細胞、顆粒細胞及老年斑內(nèi)也有陽性表達。模型組海馬內(nèi)出現(xiàn)多個老年斑,Ab1-40在老年斑內(nèi)圍繞著核心出現(xiàn)陽性表達,并在周圍出現(xiàn)散在陽性表達;電針治療組Ab1-40在腦微血管陽性表達降低,海馬內(nèi)老年斑數(shù)量及面積明顯減少,核心斑塊周圍Ab1-40陽性表達變淺,老年斑周圍微血管壁Ab1-40陽性表達亦變淺;空白對照組海馬內(nèi)未見老年斑,腦微血管壁Ab1-40陽性表達極其微弱。由表4可知,各組間海馬腦微血管壁Ab1-40積分

圖2　海馬微血管壁Ab1-42及其老年斑表達情況(免疫組化í400)

圖3　海馬微血管壁Ab1-40及其老年斑表達情況(免疫組化í400)

光密度IOD具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。兩兩比較可知,模型組海馬腦微血管壁IOD大于空白對照組(P＜

0.05),電針治療組海馬腦微血管壁IOD小于模型組(P

＜0.05)。

表4　各組小鼠海馬腦微血管壁Ab1-40積分光密度(IOD)比較(±s)

表4　各組小鼠海馬腦微血管壁Ab1-40積分光密度(IOD)比較(±s)

注:與空白對照組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別　n　海馬腦微血管壁Ab1-40IOD空白對照組　6　1435.91±574.76模型組　6　5062.05±1482.021)電針治療組　6　1954.89±1256.522)

3　討論

在AD病理過程中,大腦神經(jīng)血管功能的衰退會導致神經(jīng)血管解偶聯(lián),發(fā)生血管退化,影響了血腦屏障腦微血管的功能,導致其對Ab的清除功能障礙,使腦內(nèi)Ab水平不斷升高,沉積形成老年斑,產(chǎn)生神經(jīng)毒性,最終使認知功能下降。腦微血管主要通過兩條途徑清除腦內(nèi)Ab,由血腦屏障主動轉(zhuǎn)運受體介導的Ab清除途徑[13]。腦血管周隙的Ab清除途徑。無論哪條腦微血管Ab清除途徑出現(xiàn)障礙,都會導致腦間質(zhì)及微血管壁出現(xiàn)Ab沉積[14-15]。在腦內(nèi)與AD病理相關(guān)的Ab主要有兩種,Ab1-40與Ab1-42。腦內(nèi)的Ab1-40約占80%～90%; Ab1-42約占10%～20%,二者共存于老年斑中[16]。其在腦內(nèi)過量沉積、聚集時,都會導致認知功能障礙[2-3,17]。為了最真實模擬Ab在腦內(nèi)的AD病理變化,本實驗選用了近年來公認度較高的AD病理動物模型APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[18]。該小鼠模型導入了具有瑞典型突變位點(Swedish KM594/595NL)的人鼠嵌合型APP基因(Mo/Hu APP695)和具有第9外顯子(dE9)突變的人PS1基因,這兩種基因共同作用,使Ab在該小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生和沉積加速[19]。研究表明,6月齡雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)能夠檢測到的老年斑和少量腦血管淀粉樣變[20-21]。故本研究選取6月齡小鼠進行實驗。根據(jù)本實驗免疫組化結(jié)果,兩種Ab均在模型組腦微血管壁出現(xiàn)陽性表達,在其海馬內(nèi)發(fā)現(xiàn)老年斑,且模型組與空白對照組相比已出現(xiàn)學習記憶障礙,這與前述研究結(jié)果相符。本實驗在空白對照組的海馬椎體細胞與顆粒細胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)陽性表達,這也許是由于使用的抗體存在抗鼠Ab的原因。有研究表明,Ab在腦微血管壁沉積既是微血管清除障礙的結(jié)果也可能是其誘因[22],當Ab在腦微血管壁沉積后,將會對微血管結(jié)構(gòu)造成破壞,如使微血管壁變薄和管腔的狹窄與彎曲,引起周細胞、內(nèi)皮細胞以及血管平滑肌細胞的死亡[23],因此Ab在海馬微血管壁沉積可能加重腦微血管清除途徑障礙,進一步加劇腦內(nèi)Ab沉積和認知功能障礙,這可能是本實驗在模型組及電針治療組海馬中可見距離淀粉樣老年斑塊較近的微血管壁Ab1-42和Ab1-40的陽性表達更明顯的原因。

根據(jù)以往針刺對阿爾茨海默病治療的研究結(jié)果,電針可改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力損害,降低其認知功能的損害和促進神經(jīng)元的再生[24-25],本團隊以前研究中也發(fā)現(xiàn)電針能夠降低7月齡小鼠腦內(nèi)Ab的水平[10]。結(jié)合本次實驗結(jié)果,電針治療組與模型組相比腦微血管壁Ab1-40和1-42的表達明顯減弱,腦實質(zhì)內(nèi)老年斑數(shù)量和面積減少,且學習記憶能力改善。說明電針通過影響腦微血管清除途徑,降低腦內(nèi)Ab水平,改善學習記憶能力損害。

綜上,從電針能夠改善小鼠腦微血管壁的Ab1-40、1-42的沉積及學習記憶能力,可以說明電針治療AD可能是通過一種機制,即恢復腦微血管對Ab的清除能力。清除腦實質(zhì)內(nèi)過量沉積的Ab,減輕其神經(jīng)毒性,從而改善AD學習記憶損害的病理性變化。該機制可能是電針治療阿爾茨海默病早期學習記憶損害的重要機制。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.04.0472

文章編號:1005-0957(2016)04-0472-05

收稿日期2015-08-20

基金項目:國家自然科學基金項目(81273826);北京中醫(yī)藥大學研究生自主課題(2015-JYB-XS-122)

作者簡介:高堂珂(1988-),男,2013級碩士生,Email:gaotangke@163. com

通信作者:薛衛(wèi)國(1968-),男,副教授,碩士生導師,研究方向為針刺治療阿爾茨海默癥的機理研究,Email:snowmanxue@163.com

Effect of Electroacupuncture on Behaviours and Hippocampal Microvascular AbDeposition in 7-month-old APP/PSI Double Transgenic Mice

GAO Tang-ke,BU Qing-yun,GAO Yang,WANG Xin,GAO Yu-shan,MAO Ying-qiu,XUE Wei-guo.

Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029,China

[Abstract]ObjectiveTo explore one mechanism of therapeutic action of electroacupuncture on Alzheimer’s disease(AD), that is,improving the way to eliminate cerebral microvascular Abby investigating the effect of electroacupuncture on hippocampal microvascular Abdeposition and learning and memory abilities in APP/PSI double transgenic mice.Method Twenty-four 7-month-old male APP/PSI double transgenic mice were randomized into model and electroacupuncture groups, 12 mice each.Same sex transgene-negative littermate mice(12 mice)constituted a blank control group.The electroacupuncture group received electric acupuncture at points Baihui(GV20)and Yongquan(KI1),15 min once every other day,for a total of six weeks.After treatment,mouse learning and memory abilities were tested using the Morris water maze.The expressions of Ab1-40 and Ab1-42 in the hippocampal microvascular wall and senile plaque were determined by immunohistochemical method. Hippocampal microvascular Ab-positive expression was semi-quantitatively analyzed using the Imagine Pro Plus software.Result The Morris water maze test showed that escape latency lengthened(P＜0.05),and the number of crossing platform and swimming time in the platform quadrant decreased(P＜0.05)in the model group compared with the blank control group.Escape latency shortened(P＜0.05),and the number of crossing platform and swimming time in the platform quadrant increased(P＜0.05)in the electroacupuncturegroupcomparedwiththemodelgroup.Theimmunohistochemicalresultsshowedthat hippocampal microvascular Ab1-42 and Ab1-40 integral optical densities were higher in the model group than in the blank control group(P＜0.05)and senile plaques appeared in the hippocampus.Hippocampal microvascular Ab1-42 and Ab1-40 integral optical densities were lower in the in the electroacupuncture group than in the model group(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture reduces mouse learning and memory impairments and hippocampal microvascular Abdeposition.Its mechanism may be that electroacupuncture improves the way of eliminating cerebral microvascularAbto decrease cerebralAbdeposition.

[Key words]Electroacupuncture;Alzheimer disease;Hippocampal microvascular wall;Amyloidb-protein;APP/PSI double transgenic mice