陳娟，董晶，彭賽輝，吳志成

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東　深圳518036)

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·綜述·

PLT- F計(jì)數(shù)低值血小板的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

陳娟，董晶，彭賽輝，吳志成

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518036)

摘要：目的探討Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀PLT-F通道在低值血小板測(cè)定中的臨床意義。方法采用Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的3種方法電阻抗法（PLT-I）、光學(xué)法（PLT-O）、熒光核酸染色法（PLT-F）進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，從精密度、低值血小板及紅細(xì)胞碎片干擾評(píng)價(jià)，并與使用抗CD61抗體的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果與電阻抗法（PLT-I）、光學(xué)法（PLT-O）相比，熒光核酸染色法（PLT-F）的重復(fù)性最好，精確度較高；在紅細(xì)胞碎片干擾實(shí)驗(yàn)中，PLT-F具有較強(qiáng)的抗干擾能力（高、低濃度組P>0.05），PLT-O次之（高濃度組P<0.01，低濃度組P>0.05）；低值血小板相關(guān)分析結(jié)果顯示3種方法都得到良好的相關(guān)性，PLT-F法的準(zhǔn)確性較高，尤其在低值血小板計(jì)數(shù)中。結(jié)論臨床常規(guī)標(biāo)本可以使用Sysmex XN-9000全自動(dòng)血液分析儀的PLT-I法檢測(cè)，當(dāng)標(biāo)本血小板數(shù)目異常或溶血時(shí)，建議使用PLT-O法或PLT-F法復(fù)查，必要時(shí)采用鏡檢法或流式細(xì)胞術(shù)。

關(guān)鍵詞：血小板計(jì)數(shù)；熒光核酸染色法；流式細(xì)胞術(shù)；低值血小板

血小板（platelet，PLT)是由骨髓造血組織中的巨核細(xì)胞產(chǎn)生，呈兩面微凸的圓盤狀或橢圓形小體，直徑只有1.5～3μm，具有維持血管內(nèi)皮完整性以及黏附、聚集、釋放、促凝和血塊收縮等功能，而血小板計(jì)數(shù)(platelet count)是測(cè)定單位容積的血液中血小板的數(shù)量[1]。臨床上血小板計(jì)數(shù)常使用血液分析儀、顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，但血小板由于體積小，容易發(fā)生黏附、聚集和變性破壞，而且不易與其它非血小板小顆粒區(qū)別，所以手工計(jì)數(shù)方法常難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。在日常檢測(cè)工作中主要使用血液分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，常利用電阻抗法對(duì)血小板進(jìn)行定量檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好、檢測(cè)速度快、成本低，但易受小紅細(xì)胞、碎片紅細(xì)胞、大血小板等影響，使結(jié)果偏高或偏低，所以當(dāng)儀器檢測(cè)報(bào)告顯示血小板數(shù)量、圖形異常或報(bào)警提示時(shí)，應(yīng)使用顯微鏡或流式細(xì)胞儀法對(duì)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核[2]，而國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）推薦的參考方法是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)[3]。為評(píng)價(jià)臨床血小板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，我們使用SYSMEX XN全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的電阻抗法（PLT-I)、光學(xué)法（PLT-O）、熒光核酸染色法（PLTF)分別對(duì)正常對(duì)照組、大血小板組、小紅細(xì)胞干擾組以及紅細(xì)胞碎片干擾組的臨床標(biāo)本進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以流式細(xì)胞儀為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院2015年1月至3月血小板計(jì)數(shù)≤50×109/L的EDTA抗凝全血標(biāo)本26例，其中男性11例，女性14例，平均年齡36.3±22.5歲，顯微鏡下觀察無血小板聚集，無碎片紅細(xì)胞增多（<1.0%)。正常對(duì)照組按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T405-2012《血細(xì)胞參考區(qū)間》參考個(gè)體選擇，兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2儀器與試劑儀器為日本SysmexXN-9000全自動(dòng)血液分析儀。美國貝克曼Navios AV40310流式細(xì)胞儀。美國Beckman-Coulter公司Z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(簡(jiǎn)稱Z2)。SysmexXN-9000儀器使用的質(zhì)控品、試劑均為日本Sysmex公司生產(chǎn)的原裝配套試劑。美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的抗CD61單抗（Phycoerythrin PE)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1收集全血標(biāo)本分別在XN-9000血液分析儀上CDC檢測(cè)通道/WPC檢測(cè)通道檢測(cè)血小板，同時(shí)在美國Beckman-Coulter公司Z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)RBC數(shù)，貝克曼Navios流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面糖蛋白CD61。

1.3.2PLT計(jì)數(shù)用ICSH推薦的PLT/RBC比值法[3]作為血小板計(jì)數(shù)的參考方法。取混勻的新鮮血5μl，加熒光素標(biāo)記物抗CD61單抗5μl，混勻并靜置15min，再加人4.99mlPBS(pH7.2的磷酸鹽緩沖液)，混勻，以貝克曼Navios流式細(xì)胞儀檢測(cè)RBC/ PLT比率，將結(jié)果乘以Z2檢測(cè)所得RBC數(shù)，即得PLT數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件及Microsoft Office Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2　結(jié)果

2.1低值血小板批內(nèi)精密度檢測(cè)用XN-9000血液分析儀PLT-I，PLT-O，PLT-F通道分別檢測(cè)3例低值血小板及正常血小板3例，按常規(guī)檢測(cè)方法分別各檢測(cè)11次，計(jì)數(shù)后10次檢測(cè)結(jié)果平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。見表1。

表1　血小板批內(nèi)精密度比較(×109/L n=10)

從表1可以看出PLT-I通道平均變異系數(shù)為5.32%，PLT-O通道平均變異系數(shù)為4.04%，PLT-F通道平均變異系數(shù)為2.61%，其中低值血小板的變異系數(shù)分別為：8.58%（PLT-I），5.79%（PLT-O），4.08%(PLT-F)。

2.2低值血小板檢測(cè)收集血小板計(jì)數(shù)（PLT-F)≤50×109/L的EDTA抗凝全血標(biāo)本26例，分別用PLT-I、PLT-0、PLT-F方法對(duì)其血小板測(cè)定，采用FCM PLT/RBC比值法檢測(cè)結(jié)果作為參照，與上述三種方法進(jìn)行比較，見圖1~圖3。

圖1　PLT-I與流式細(xì)胞術(shù)比較

圖2　PLT-0與流式細(xì)胞術(shù)比較

圖3　PLT-F與流式細(xì)胞術(shù)比較

2.3碎片紅細(xì)胞干擾試驗(yàn)[4，5]取1份正常人EDTA抗凝血樣分裝4管(每管800μl)，將第1管3600r/ min離心5min后，取壓積紅細(xì)胞層100μl，加入蒸餾水振蕩搖勻后，3600r/min離心5min，留取底層紅細(xì)胞碎片，用生理鹽水洗滌3次后稀釋至200μl，取上述紅細(xì)胞碎片懸液80μl，加入第2管血樣中，作為高碎片濃度干擾組，再將剩下紅細(xì)胞碎片懸液120μl加生理鹽水至1ml，取80μl加入第3管中，作為低碎片干擾組。將第4管加入80μl生理鹽水作為對(duì)照組。用PLT-I、PLT-0、PLT-F方法對(duì)上述第2、3、4管PLT進(jìn)行檢測(cè)（檢測(cè)2次），以第2、3 管PLT測(cè)定值與第4管PLT測(cè)定值作配對(duì)t檢驗(yàn)(n=10)。見表2。

表2　紅細(xì)胞碎片干擾試驗(yàn)結(jié)果(n=10)

從表2可以看出使用SYSMEX XN全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板的結(jié)果分別與自身對(duì)照組作配對(duì)t檢驗(yàn)。由表4可以看出電阻抗法（PLT-I)易受到紅細(xì)胞碎片的干擾（高濃度組P<0.01，低濃度組P<0.05），而光學(xué)法（PLT-O）有一定的抗紅細(xì)胞碎片的干擾能力（高濃度組P<0.01，低濃度組P> 0.05），熒光核酸染色法（PLT-F)則有較強(qiáng)的抗紅細(xì)胞碎片干擾能力，不易受到血液中非血小板小顆粒影響[6]。

3　討論

血小板疾病是由于血小板數(shù)量減少或功能減退導(dǎo)致止血栓形成不良和出血而引起的。血小板減少癥可能源于血小板產(chǎn)生不足，脾臟對(duì)血小板的阻留，血小板破壞或利用增加以及被稀釋，無論何種原因所致的嚴(yán)重血小板減少，都可引起典型的出血。因此血小板計(jì)數(shù)是臨床常用的檢驗(yàn)項(xiàng)目之一，其結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)于血栓性疾病和出血性疾病的診斷與治療起著決定性作用，特別低值血小板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性一直是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和臨床關(guān)注的問題，當(dāng)血小板<50×109/L患者出血風(fēng)險(xiǎn)大大增加，臨床癥狀可表現(xiàn)為出血，如鼻、齒齦、黏膜自發(fā)性出血等，應(yīng)引起臨床醫(yī)生高度重視[7]，當(dāng)血小板計(jì)數(shù)< 20×109/L，一般認(rèn)為應(yīng)進(jìn)行預(yù)防性血小板輸血[8，9]。

目前血小板計(jì)數(shù)多使用各類血液分析儀完成，其計(jì)數(shù)原理多為經(jīng)典的電阻抗法，但此方法受到的影響因素較多，目前認(rèn)為影響因素主要為大血小板及小紅細(xì)胞、小血小板、血小板體積差異過大等[10-12]。為了保證血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，Sysmex XN血液細(xì)胞分析儀可以采用電阻抗法，光學(xué)法和熒光核酸染色法三種方法對(duì)血小板進(jìn)行檢測(cè)。阻抗法根據(jù)顆粒體積大小通過小孔時(shí)產(chǎn)生的脈沖信號(hào)不同來區(qū)別和計(jì)數(shù)血小板，而光學(xué)法和熒光核酸染色法采用了流式細(xì)胞術(shù)原理，根據(jù)對(duì)血小板核酸成份的熒光染色，測(cè)定熒光強(qiáng)度來計(jì)數(shù)血小板，消除了小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片的干擾[13]，其中光學(xué)血小板法使用聚甲烯次甲基熒光染料對(duì)血小板的核酸成份進(jìn)行熒光染色，通過網(wǎng)織紅通道RET進(jìn)行測(cè)量，利用表達(dá)細(xì)胞大小的前向散射光FSC和表達(dá)核酸濃度的側(cè)向熒光SFL來識(shí)別血小板。因血小板體積較紅細(xì)胞小，分布在紅細(xì)胞下方，血小板內(nèi)含極少量的核酸，側(cè)向熒光的強(qiáng)度較成熟紅細(xì)胞稍大，因此能有效區(qū)分紅細(xì)胞和血小板。而熒光核酸染色法（PLT-F)較光學(xué)法（PLTO）多增加3倍PLT計(jì)數(shù)量，并針對(duì)血小板內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體進(jìn)行嗪染料熒光染色，使血小板和碎片紅細(xì)胞間熒光強(qiáng)度差異變得更大，提高儀器辨別能力，減少非血小板顆粒干擾，通過血小板碎片干擾試驗(yàn)可知熒光核酸染色法（PLT-F)有較強(qiáng)的抗紅細(xì)胞碎片干擾能力，不易受到血液中非血小板小顆粒影響，能準(zhǔn)確檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)。

血液分析儀一般采用浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)等來保證血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，在一般情況下儀器可以區(qū)分血小板和紅細(xì)胞。但當(dāng)血小板形態(tài)異常時(shí)，由于其形態(tài)不典型，直方圖易與紅細(xì)胞直方圖重疊，儀器不能進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)[14]，此時(shí)應(yīng)使用顯微鏡或流式細(xì)胞儀法對(duì)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核[15]。但實(shí)際應(yīng)用中由于光學(xué)法及熒光核酸染色法（PLT-F)成本較高，常規(guī)檢測(cè)工作中習(xí)慣使用阻抗法，當(dāng)出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)<80×109/L、血小板直方圖異常、碎片紅細(xì)胞、小紅細(xì)胞及血小板聚集時(shí)，可使用光學(xué)法（PLT-O）或熒光核酸染色法（PLT-F)對(duì)血小板計(jì)數(shù)行進(jìn)復(fù)檢，必要時(shí)涂片進(jìn)行鏡檢。而國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）推薦的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)因費(fèi)時(shí)成本高，標(biāo)本保留時(shí)間短，且需要專業(yè)技術(shù)人員操作，常規(guī)血小板檢測(cè)工作中較少使用，一般應(yīng)用于有條件臨床實(shí)驗(yàn)室建立PLT參考方法并用于評(píng)價(jià)其它PLT計(jì)數(shù)方法[16]。

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·實(shí)驗(yàn)研究·

中圖分類號(hào)：R446.11+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)03-0288-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.010

基金項(xiàng)目：北京大學(xué)深圳醫(yī)院種子基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015021）

作者簡(jiǎn)介：陳娟，女，1980年5月生，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作，wwwwzch@sohu.com。

(收稿日期2016-04-25；修回日期2016-05-16)

Accuracy evaluation of PLT - F method on low concentration of platelet counting

CHEN Juan，DONG Jing，PENG Saihui，WU Zhicheng. Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong Shenzhen 518036，China.

Abstract：Objective To evaluate the accuracy of PLT-F channel on low platelet counting in the SysmexXN-9000 automated hematology analyzer. Methods Blood samples with low platelet concentration or those mixed with erythrocyte fragments were detected with SysmexXN-9000 automated hematology analyzer using three platelet count methods：PLT-F，PLT-I，and PLT-O. As comparison，the samples were labeled with CD61 antibody，and analyzed using flow cytometry. Results PLT-F method showed higher reproducibility and accuracy in comparison with PLT-I method and PLT-O method. Platelet count by PLT-F method were less affected by erythrocyte fragments than that by PLT-O method. There was a better correlation between the PLT-F system and the immunological reference method，despite of samples with low platelet concentration. Conclusions This study revealed that PLT-I method can accurately count platelets in the clinical routine blood samples. However，blood samples with low platelet concentration or those containing erythrocyte fragment should be reviewed by PLT-O or PLT-F methods，even by microscopy or flow cytometry if necessary.

Key words:Platelet counting；PLT-F；Flow cytometry；Low platelet