張運津，章桂嬌，徐青青，吳虹，葛秀華，鐘小蘭

(南昌三三四醫(yī)院腎內(nèi)科，江西　南昌330024)

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·論著·

miRNA - 374a在狼瘡腎炎患者血清中的表達及其意義

張運津，章桂嬌，徐青青，吳虹，葛秀華，鐘小蘭

(南昌三三四醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌330024)

摘要：目的探討狼瘡腎炎患者血清miRNA-374a的表達情況及其意義。方法運用TargetScan靶基因預(yù)測分析軟件等生物信息學(xué)方法，預(yù)測miRNA-374a靶基因并進行分析；采用qRT-PCR方法檢測miRNA-374a、MCP-1在狼瘡腎炎患者血清和健康對照組血清的表達變化，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果生物信息學(xué)分析顯示MCP-1為狼瘡腎炎的靶基因；與健康對照組相比，miRNA-374a在狼瘡腎炎患者血清低表達(P<0.05)，MCP-1在狼瘡腎炎患者血清高表達(P<0.05)；miRNA-374a、MCP-1的表達水平與年齡沒有明顯關(guān)系(P>0.05)，與臨床分期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論miRNA-374a在狼瘡腎炎患者血清中低表達，可能通過對其下游靶基因MCP-1的調(diào)控，在狼瘡腎炎發(fā)生過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：miRNA-374a；MCP-1；狼瘡腎炎；實時定量PCR

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最重要的臟器損害和主要死亡原因之一。miRNA是天然的基因調(diào)控因子，它在細(xì)胞分化、血管形成、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等病理生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。研究表明差異表達的miRNA與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[2-7]，miRNA有望成為早期的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點。目前，miRNA-374a在LN的研究情況尚未見報道。本課題擬通過對miRNA-374a進行生物信息學(xué)分析預(yù)測其靶基因，檢測miRNA-374a及其靶基因MCP-1在LN患者血清中的表達變化，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系，旨在探討miRNA-374a在LN發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。

1　材料與方法

1.1研究對象所有研究對象均為南昌三三四醫(yī)院住院和門診患者。LN診斷標(biāo)準(zhǔn)：確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者，具備下述4項標(biāo)準(zhǔn)中3項：⑴持續(xù)蛋白尿為2～4+；⑵血漿中白蛋白≤35g/L；⑶尿液中見紅細(xì)胞、顆?；蛳灅庸苄停虎饶蛞虹R檢紅細(xì)胞5/HPF。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴除外各種混合性結(jié)締組織病；⑵除外心、腦、腎、肝及造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾?。虎桥懦癫?、內(nèi)分泌代謝病及妊娠期婦女。收集其血清標(biāo)本共計18例，均為女性；年齡35～72歲，平均56.8歲；根據(jù)靜止期和活動期分為兩組：LN活動性腎損害組7例，LN非活動性腎損害組11例，另選15例健康體檢的正常女性血清作為健康對照組。

1.2主要儀器與試劑德國Biometra Tpersonal PCR儀，美國ABI實時定量PCR儀step one plus。北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量PCR試劑盒，F(xiàn)ermentas的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司的2×EsyTaq PCR SuperMix試劑盒。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR檢測miRNA-374a、MCP-1的表達按試劑盒說明書操作。分別以U6和GAPDH為miRNA-374a和MCP-1的內(nèi)參。miRNA-374a下游引物是試劑盒的通用引物，其余引物序列及PCR產(chǎn)物片斷大小見表1。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。

表1　PCR引物序列

1.3.2生物信息學(xué)預(yù)測miRNA-374a的靶基因利用TargetScan（http://www.targetscan.org）、PicTar（http: //pictar.mdc-berlin.de）、miRanda（http://www.microrna.org）、miRDB (http://mirdb.org)4個軟件在線預(yù)測miRNA-374a的靶基因。

1.3.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25，P75)]表示，采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩樣本比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miRNA-374a的靶基因預(yù)測TargetScan預(yù)測miRNA-374a靶基因為179個，miRanda預(yù)測為7557個，miRDB預(yù)測為677個，PicTar預(yù)測為125個。預(yù)測結(jié)果顯示miRNA-374a調(diào)節(jié)的靶基因范圍非常廣泛。MCP-1是其中之一。

2.2miRNA-374a、MCP-1在兩組血清中的表達情況qRT-PCR顯示miRNA-374a在LN組的表達明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。MCP-1在LN組的表達高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1　兩組血清標(biāo)本miRNA-374a表達比較

圖2　兩組血清標(biāo)本MCP-1表達比較

2.3miRNA-374a、MCP-1的表達與LN臨床參數(shù)間的關(guān)系miRNA-374a、MCP-1的表達水平與年齡沒有明顯關(guān)系(P>0.05)。但均與臨床分期有關(guān)(P＜0.05)。見表2。表2 miRNA-374a、MCP-1的表達與LN臨床參數(shù)間的關(guān)系

注：*P＜0.05。

3　討論

miRNA-374a位于人染色體Xq13.2，目前研究較少僅有少量文獻報道，具體功能尚不明確。Vosa U等[8]研究表明，與正常組織相比，在非小細(xì)胞肺癌的癌組織中miRNA-374a低表達，低表達的miRNA-374a在非小細(xì)胞肺癌的早期階段可以作為患者危險分層和預(yù)后標(biāo)記，可能是一個有前途的治療肺癌的治療目標(biāo)。田瑞等[9]通過高通量基因芯片測得并經(jīng)熒光定量PCR證實miRNA-374a在乳腺癌中的表達水平明顯低于正常乳腺組織，且在低侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達量明顯高于高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌，提示miRNA-374a在乳腺癌中可能發(fā)揮著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。該團隊[10]還證明miRNA-374a與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)。Cai J等[11]則通過體內(nèi)體外實驗表明，miRNA-374a的高表達通過Wnt/β-catenin途徑促進的EMT的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究利用qRT-PCR方法檢測miRNA-374a 在LN患者血清和健康對照組血清的表達情況，發(fā)現(xiàn)miRNA-374a在LN患者血清中低表達，提示miRNA-374a可能在LN發(fā)生過程中起著重要作用。低表達的miRNA-374a與年齡沒有明顯關(guān)系，但與臨床分期有關(guān)，說明下調(diào)的miRNA-374a與狼瘡腎炎的疾病活動情況密切相關(guān)。

靶基因預(yù)測分析的結(jié)果顯示miRNA-374a調(diào)節(jié)的靶基因范圍非常廣泛，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫調(diào)節(jié)等各個方面。單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是其中之一。MCP-1又稱單核細(xì)胞趨化激活因子(monocyte chemoattractant activating factor，MCAF)是趨化因子CC亞家族的一員。MCP-1基因位于17號染色體，含有三個外顯子，兩個內(nèi)含子，其cDNA的開放閱讀框架含有297個堿基編碼MCP-1蛋白。MCP-1可由多種細(xì)胞合成和分泌，其中主要是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，腎組織內(nèi)的系膜細(xì)胞也可合成和分泌。

研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1是LN炎癥細(xì)胞浸潤腎臟的信號，介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞的遷移、募集及組織的損傷，促進腎小球新月體形成和腎間質(zhì)的損害[12]。Dai 等[13]采用免疫組織化學(xué)的方法，對18例腎活檢為LN的女性患者的MCP-1蛋白和細(xì)胞進行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LN患者腎組織中MCP-1蛋白分布廣泛，16例在腎小管表皮細(xì)胞的基底側(cè)，9例在間質(zhì)血管壁，CD68+，CD4+和CD8+細(xì)胞大量聚集。腎小管MCP-1的表達與CD68+細(xì)胞聚集的量以及腎間質(zhì)纖維化程度關(guān)系密切。劉中娟等[14]應(yīng)用ELISA和RT-PCR方法測定112例SLE患者、30例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者、11例非SLE腎損傷患者及40例正常健康者血清MCP-1水平、外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）MCP-1 mRNA水平；結(jié)果表明狼瘡腎炎活動組患者PBMCs MCP-1 mRNA水平表達增加最為顯著，MCP-1血清水平也較非活動組及正常對照組明顯升高。說明上調(diào)的MCP-1與狼瘡腎炎的疾病活動情況密切相關(guān)。陳泉池等[15]通過靶基因預(yù)測、雙熒光素酶實驗及Western blot實驗等研究證實，miRNA-374a可能通過其靶基因MCP-1發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用。

本研究結(jié)果表明MCP-1在LN患者血清中高表達，活動性腎損害組MCP-1血清水平較非活動性腎損害組明顯升高。說明高表達的MCP-1與狼瘡腎炎的疾病活動情況有關(guān)。

綜上所述，推測在LN中，低表達的miRNA-374a可能通過對其靶基因調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用，從而參與LN的發(fā)生發(fā)展。具體機制尚需細(xì)胞學(xué)實驗進一步證實。

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中圖分類號：R593.24+2，R522

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0274-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.005

基金項目：江西省衛(wèi)計委基金資助項目（編號：20154011）

作者簡介：張運津，男，1970年5月生，學(xué)士學(xué)位，副主任醫(yī)師。主要從事腎內(nèi)科工作。

(收稿日期2016-02-18；修回日期2016-03-25)

Expression and significance of serum miRNA - 374a in patients with lupus nephritis

ZHANG Yunjin，ZHANG Guijiao，XU qingqing，et al. Department of Nephrology，Nanchang 334 Hospital，Nanchang 330024，China.

Abstract：Objective To investigate serum miRNA-374a expression in patients with lupus nephritis and its clinical significance. Methods Target genes of miRNA-374a were predicted by bioinformatics methods such as TargetScan and closely related gene with lupus nephritis were screened. The expression levels of serum miRNA-374a and MCP-1 in patients with lupus nephritis and healthy controls were detected using qRT-PCR，and the correlations between those and clinical parameters were analyzed. Results Bioinformatics analysis revealed that of miRNA-374a target genes was MCP-1 in lupus nephritis. Compared with healthy controls，serum miRNA-374a was significantly lowly expressed in patients with lupus nephritis while MCP-1 was significantly highly expressed(P<0.05)；expression levels of miRNA-374a and MCP-1 showed no significant correlation with age(P>0.05)，but with clinical stages (P<0.05). Conclusion Low expression of miRNA-374a was detected in the serum of patients with lupus nephritis. It may play an important role in the pathogenesis and progression of lupus nephritis by regulating the downstream target gene MCP-1.

Key words:miRNA-374a；MCP-1；Lupus nephritis；Quantitative real-time PCR