王立楓，馬 鶯，李 琳，崔 杰

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150090）

牦牛β-乳球蛋白分離純化及在不同pH值溫度的變性研究

王立楓，馬 鶯，李 琳，崔 杰

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150090）

通過采用反向液相色譜（RP-HPLC）對(duì)不同方法分離乳清蛋白的結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)分離純化的牦牛β-乳球蛋白進(jìn)行，其蛋白純度達(dá)到90%以上。另外使用非變性凝膠電泳（Native-PAGE）對(duì)不同pH值、不同加熱溫度條件下牦牛β-乳球蛋白的變性條件及變性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，牦牛β-乳球蛋白的變性溫度在80℃左右。蛋白變性含量隨著加熱溫度和pH值的增加成上升趨勢(shì)。加熱至90℃后蛋白變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加顯著在pH6和pH9條件下未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24%和9%。

牦牛β-乳球蛋白；乳清蛋白；熱處理；蛋白變性

0 引言

牦牛生活在海拔3 000 m以上的青藏高原，生存環(huán)境相當(dāng)極端包括低溫、低壓、缺氧、紫外照射強(qiáng)等特點(diǎn)。中國牦牛數(shù)量達(dá)到1 500萬頭左右總量占全世界90%以上。中國牦牛數(shù)量持續(xù)增長，僅在水牛和黃牛之后排第三位［1-3］。

牦牛乳清蛋白的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)占蛋白總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的20%以上，牦牛乳β-乳球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)占乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)總數(shù)的50%以上［4-5］，乳清蛋白的分離有多種方法，如反向膠束萃取法、吸附分離法、色譜提純法以及膜分離技術(shù)［6］。牦牛β-乳球蛋白可以廣泛應(yīng)用于嬰兒食品，保健品，化妝品等工業(yè)生產(chǎn)中，本實(shí)驗(yàn)深入研究β-乳球蛋白分離提純方法以及在不同pH值和溫度條件其變性條件、變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這也更好的開發(fā)牦牛乳清蛋白也可以促進(jìn)牦牛乳的工業(yè)化發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料是采集于四川省阿壩縣的牦牛乳樣品，采集的樣品加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的疊氮化鈉并在-18℃冷凍，并迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牦牛乳乳清蛋白分離實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀，全譜直讀電感耦合等離子器，離子色譜儀（ICS-3000），離心機(jī)，Sigma 3-30K臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，超濾機(jī)；美國密理博Millipore超濾系統(tǒng)，電泳儀（Bio-Rad 165-3361）。

2 方法

2.1 牦牛乳脫脂

將牦牛乳置于流水條件下解凍至室溫，置于離心杯中3 000 g離心30 min，使用紗布過濾離心后的牦牛乳得到脫脂牦牛乳。

2.2 不同方法分離牦牛乳清

2.2.1 酸沉法制備牦牛乳乳清的制備

使用濃度0.1 mol/L的乳酸調(diào)節(jié)牦牛乳pH值至4.6，將調(diào)好pH值的牦牛乳置于離心杯中5 000 g離心30 min，使用0.45 μm濾膜過濾離心后的牦牛乳乳清。得到蛋白的濾過液。

2.2.2 使用高速離心分離牦牛乳乳清

將牦牛乳置于離心機(jī)中20 000 g離心1 h，離心后酪蛋白酵素產(chǎn)生沉淀，同時(shí)乳清溶解在上清液中。

2.2.3 使用超濾系統(tǒng)提取β-乳球蛋白

將過濾的牦牛乳乳清置于蛋白超濾系統(tǒng)中，使用分子量為50 ku濾膜進(jìn)行超濾，取濾過液為牦牛乳乳清。

2.3 牦牛乳β-乳球蛋白的分離

β-乳球蛋白的分離主要參考Alomirah［7］等人的實(shí)驗(yàn)方法。首先使用濃度為0.15 mol/L的檸檬酸鈉調(diào)節(jié)乳清pH值至3.9，在35℃條件下恒溫靜置1 h。之后將靜置的乳清溶液在4℃條件下10 000 g離心30 min。其中β-乳球蛋白溶解于上清液中，而α-乳白蛋白則存在與沉淀相中。之后上清液以及沉淀相中分別用7%的NaCl溶液洗滌之后再次10 000 g離心30 min后，β-乳球蛋白則分別存在與上清沉淀中。用去離子水溶解β-乳球蛋白在4℃條件下使用分子量3 ku的透析膜透析24 h，凍干得到分離出的β-乳球蛋白。

2.5 對(duì)分離出的β-乳球蛋白的檢測(cè)

牦牛乳蛋白分析參考Li等人的方法［8］。選用Sigma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。取1 mL牦牛脫脂乳分散到4 mL緩沖液中（濃度為8 mol/L尿素，濃度為0.165 mol/L的Tris溶液，濃度0.044 mol/L檸檬酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為0.3%的二巰基乙醇）。RP-HPLC系統(tǒng)為Agilent1100。柱類型及規(guī)格：Jupiter C4 column（250mm×4.6mm，300A sizedpores，5 μm sized particles）。檢測(cè)波長為220 nm，溫度為30℃，進(jìn)樣量為20 μL，洗脫液流速為0.8 mL/min。洗脫液：A和B兩種洗脫液，A為色譜純的水（加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸），B為色譜純的乙腈（加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸）。洗脫條件為：上樣前先用A液平衡，上樣后0～40min B液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從30%升到50%；40～42 min B液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從50%升到100%；42～43 min B液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%；43～46min B液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從100%降到30%，然后再用起始洗脫液洗脫5 min，總洗脫時(shí)間為51 min。用牦牛乳的HPLC圖譜對(duì)比對(duì)照分離出的β-乳球蛋白的純度。

2.6 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及純度的分析

取提純凍干的β-乳球蛋白以質(zhì)量濃度為50 g/L溶解于蛋白裂解液中，經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)后與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)比計(jì)算可得蛋白質(zhì)量濃度及純度。

2.7 對(duì)牦牛乳β-乳球蛋白在不同pH和溫度條件下的處理

將提純的牦牛β-乳球蛋白以質(zhì)量濃度為50 g/L分別溶解于pH值為6.0，7.0，8.0，9.0。其濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液中。水浴加熱蛋白溶液使其加熱溫度增加至60，65，70，75，80，85，90℃。加熱時(shí)間10 min。

2.8 對(duì)加熱后β-乳球蛋白進(jìn)行非變性電泳分析

2.8.1 樣品處理

2×非變性樣品緩沖液不含SDS和巰基乙醇（1.25 mL，pH 6.8，0.5 moL的Tris-Hcl，3.0 mL甘油，0.2 mL溴酚藍(lán)，5.5 mL水），將不同溫度下加熱的β-乳球蛋白樣品加入2×非樣品緩沖液等體積混合樣品僅需用混勻儀震蕩充分混合而不加熱。10 μL進(jìn)樣。

2.8.2 電泳及分析

分離膠質(zhì)量濃度為8%濃縮膠質(zhì)量濃度為5%凝膠厚度為1 mm的垂直不連續(xù)Native-PAGE緩沖系統(tǒng)不含SDS預(yù)電泳電流為15 mA樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)到20 mA。為防止蛋白質(zhì)在電泳過程中變性電泳在0～4℃進(jìn)行。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，之后使用甲醇冰醋酸溶液脫色觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同條件下取得的牦牛乳乳清溶液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如圖1所示，本研究使用了3種方法得到分離牦牛乳清溶液。圖1中，表明牦牛乳在20 000 g離心時(shí)間1 h得到的乳清溶液中雖然酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯降低，但是在溶液中依然有大量的酪蛋白存在。乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的35%左右。在離心力為20 000 g的條件下，雖然離心力促使部分酪蛋白產(chǎn)生沉淀，但離心力不足以使的所有酪蛋白都發(fā)生沉淀。

使用酸沉法分離得到的乳清溶液中乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%左右，但是依然有少量的酪蛋白存在與乳清溶液中。是因?yàn)樵陉笈Ｈ橹杏写蠹s3%～5%的酪蛋白在酸沉之后依然以溶解形態(tài)存在于乳清溶液中。因?yàn)樗岢练m然可以沉淀大量的酪蛋白，但是沒有辦法分離出牦牛奶中所有的酪蛋白。

酸沉后的乳清溶液經(jīng)超濾系統(tǒng)中使用50 ku超濾膜過濾取得濾過液，可以從圖1中看出在超濾后乳清溶液中只含有β-乳球蛋白和α-乳白蛋白且乳清溶液中沒有其余蛋白存在，這是因?yàn)楫?dāng)乳清酸沉之后，使用超濾系統(tǒng)對(duì)溶液中乳清蛋白進(jìn)行了分離，超濾操作中選擇了分子量為50 ku的分子濾膜。所以在超濾的過程中分子量大于50 ku的蛋白分子被截留，使得乳清溶液中分子量比較大的分子如血清白蛋白，以及酪蛋白膠束等一些大的分子量的蛋白不能進(jìn)入到濾過液中，因此在濾過液中得到的乳清蛋白溶液中僅有β-乳球蛋白和α-乳白蛋白［9］。

圖1 使用不同方法取得乳清蛋白的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3.2 牦牛乳β-乳球蛋白的分離純化

圖2所示，對(duì)經(jīng)過分離純化后得到的β-乳球蛋白粉末進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè)其蛋白含量的純度及濃度。結(jié)果表明在β-乳球蛋白和α-乳白蛋白分別在洗脫的時(shí)間31 min和34 min出現(xiàn)了單獨(dú)的吸收峰。且沒有其他吸收峰的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)表明β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分離效果十分明顯。經(jīng)計(jì)算實(shí)驗(yàn)分離的β-乳球蛋白的蛋白純度都達(dá)到90%以上。是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中加入的檸檬酸鈉溶液可以在低pH條件下與α-乳白蛋白中的Ca2+離子產(chǎn)生螯合物。使其疏水基團(tuán)暴露，在高速離心條件下會(huì)產(chǎn)生沉淀［10］。同時(shí)β-乳球蛋白以為其自身性質(zhì)可以很好的溶解于溶液中，因此沉淀蛋白只有α-乳白蛋白?？紤]到乳清中α-乳白蛋白不會(huì)完全沉淀，在溶液中加入NaCl溶液使在溶液中本部穩(wěn)定的α-乳白蛋白產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，并再次離心促使α-乳白蛋白全部沉淀。

因此β-乳球蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在分離純化的過程中會(huì)因操作步驟等原因有一定程度的損失。同時(shí)也保證了乳清蛋白在分離純化中β-乳球蛋白的純度。在蛋白提取后在4℃條件下透析水中透析24 h則是過濾提取乳清蛋白中加入的無機(jī)鹽以及小的氨基酸肽段。同時(shí)保證了β-乳球蛋白提取的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及蛋白純度。

圖2 使用HPLC測(cè)定提取β-乳球蛋白純度

3.3 Native-PAGE分析變性情況

使用Native-PAGE對(duì)β-乳球蛋白在不同pH值和溫度下變性情況進(jìn)行分析。圖3表明當(dāng)加熱溫度在低于75℃，在所有的pH值范圍內(nèi)天然β-乳球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都沒有降低，說明在加熱至75℃條件下依然可以保持β-乳球蛋白發(fā)生活性。當(dāng)溫度增加至80℃，所有pH條件下天然β-乳球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有明顯的降低。表明在80℃條件下加熱10 min后β-乳球蛋白開始發(fā)生變性。當(dāng)加熱溫度從80℃增加至90℃，變性β-乳球蛋白上升程度明顯，90℃條件下加熱后的天然β-乳球蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極低其電泳條帶幾乎消失。

使用蛋白分析軟件分析非變性電泳蛋白中未變性β-乳球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在加熱至80℃，85℃以及90℃條件下，圖4所示，隨著pH值和加熱溫度的逐漸增加變性β-乳球蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也呈逐漸增加趨勢(shì)，當(dāng)pH增加至9時(shí)變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高。在pH6的條件下非變性蛋白在加熱后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%，43%及24%。在pH值為9的條件經(jīng)不同溫度加熱后非變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低至58%，24%及9%。pH值對(duì)蛋白變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化有明顯的影響。在不同pH值條件下當(dāng)溫度達(dá)到80℃以上時(shí)β-乳球蛋白達(dá)到其變性溫度，此時(shí)β-乳球蛋白變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯增加，這與先前的研究結(jié)果相似［11］。蛋白變性的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻不相同，在相同加熱溫度的條件下，隨著pH的逐漸增加變性的β-乳球蛋白也逐漸增加與之前的研究的結(jié)果相似［12］，這是因?yàn)閜H會(huì)影響β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)。導(dǎo)致其在正常條件下包埋游離的巰基更容易與二硫鍵重新交換組合進(jìn)而導(dǎo)致β-乳球蛋白變性。牦牛β-乳球蛋白與牛乳中的β-乳球蛋白的性質(zhì)相似，但其在非變性電泳條件下得到的位置卻有所不同，說明雖然兩種牛乳中的β-乳球蛋白性質(zhì)相似，但還是略微有所不同。

圖3 不同pH值和加熱溫度下加熱10 min后β-乳球蛋白熱變性的變化

圖4 pH不同加熱之間相同后非變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

4 結(jié)論

對(duì)比酸沉法與離心法分離的乳清溶液，酸沉法分離提取的乳清溶液中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為5%遠(yuǎn)低于離心法提取乳清溶液。而經(jīng)過超濾系統(tǒng)分離的乳清溶液中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎沒有。更加適用于實(shí)驗(yàn)室條件分離提取牦牛β-乳球蛋白。但采取超濾法得到的乳清溶液在大量降低酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同時(shí)，乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯的降低。在實(shí)驗(yàn)室條件下使用超濾法提取的乳清蛋白溶液可以有效的分離提取出純度達(dá)到90%以上濃度達(dá)到80%以上的β-乳球蛋白。

牦牛乳β-乳球蛋白加熱至80℃條件下產(chǎn)生變性，β-乳球蛋白變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨加熱溫度的增加而逐漸增加，當(dāng)加熱至90℃條件下β-乳球蛋白幾乎全部變性。同時(shí)隨著溶液中pH值的增高而降低。加熱溫度對(duì)β-乳球蛋白的變性起到?jīng)Q定性的影響。

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Research of separate Yakβ-Lactoglobulin and denaturation at different pH and heating temperature

WANG Li-feng，MA Ying，LI Lin，CUI Jie
（Chemical Engineering and Technology，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

Yak whey protein obtained by different methods analyzed by RP-HPLC.The purity of separationβ-lactoglobulin was more than 90%.Using Native-PAGE to detected the condition and content of yakβ-lactoglobulin denaturation at different pH（6.0 to 9.0）and heating temperature（60 to 90℃）.The results shown that the denaturation ofβ-lactoglobulin was about 80℃，and the content of denaturationβ-lactoglobulin was increased with pH and heating temperature increased.With heating temperature to 90℃，the content of native β-lactoglobulin was 24%and 9%at pH6.0 and pH9.0 respectively.

yakβ-lactoglobulin；whey protein；heat-treatment；protein denaturation

TS252.1

A

1001-2230（2016）08-0017-04

2016-03-03

王立楓（1983-），男，博士研究生，主要從事乳品科學(xué)研究。

馬鶯