孫金金，朱金鑫，王 娟，楊宇明，王 毅

(1.西南林業(yè)大學，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)科學院 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物繁育和保護重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南省林業(yè)科學院 云南省森林培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南 昆明 650201)

巨龍竹肉桂醇脫氫酶基因(DsCAD)的克隆及功能分析

孫金金1,2，朱金鑫1,2，王 娟2,3，楊宇明2,3，王 毅2,3

(1.西南林業(yè)大學，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)科學院 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物繁育和保護重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南省林業(yè)科學院 云南省森林培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南 昆明 650201)

肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)是木質素生物合成途徑的關鍵酶。研究根據(jù)巨龍竹轉錄組數(shù)據(jù)設計的一對特異引物，運用逆轉錄PCR(RT-PCR)技術從巨龍竹莖稈中克隆得到肉桂醇脫氫酶基因DsCAD，該基因包含1080 bp的完整cDNA開放閱讀框，編碼359個氨基酸，理論相對分子質量38689.6，等電點6.18。利用生物信息學方法對DsCAD進行分析，結果顯示：DsCAD氨基酸序列包含CAD超家族的保守結構域，具有植物CAD基因的典型特征；其與禾本科植物CAD基因的同源性較高，親緣關系較近，其中與孝順竹的同源性高達95%。熒光定量PCR檢測結果顯示DsCAD基因在巨龍竹竹筍中的表達量要高于莖稈，而在莖稈中的表達量有明顯高于葉。

肉桂醇脫氫酶；巨龍竹；基因克??；熒光定量

木質素是由苯丙烷單體組成的復雜的酚類聚合物，主要存在于植物的次生細胞壁中，是生物圈中最豐富的生物聚合物之一，在植物體中的含量僅次于纖維素。作為填充和黏合物質，木質素在細胞壁中與纖維素和半纖維素等多糖分子相互緊密粘合，可以增強植物體的機械強度和疏水性，同時也是植物對抗病原體和各種外界侵害的物理屏障[1-2]。但是，由于結構復雜難以降解，木質素的存在對木質纖維的開發(fā)利用造成不利影響，成為牧草消化、植物化學制漿和木質纖維轉化為生物乙醇等過程中的限制性因素[3]。木質素主要通過苯丙烷途徑和木質素特異途徑合成，這一過程從苯丙氨酸或酪氨酸的脫氫基開始，再經過羥基化、甲基化和氧化還原反應生成木質素單體的3種前體物質——香豆醇(p-coumaryl alcohol)、芥子醇(sinapyl alcohol)及松柏醇(coniferyl alcohol)，它們分別聚合為對-羥基苯基(p-hydroxyphenyl，H型)、紫丁香基(syringyl，S型)和愈創(chuàng)木基(guaiacyl，G型)3種木質素單體[4]。肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)是木質素生物合成途徑最早被研究的酶之一，在木質素合成途徑中具有非常重要的作用。CAD屬于NADPH依賴性酶，作用于木質素單體生物合成的最后一步，催化肉桂醛(香豆醛、芥子醛和松柏醛)還原成相應的肉桂醇(香豆醇、芥子醇和松柏醇)，這些肉桂醇是生成木質素單體的前體物質[5]。自1973年CAD基因被發(fā)現(xiàn)以來，國內外學者利用分子生物學等對其酶學性質、組成結構、克隆及轉基因等方面進行了研究，并取得了一定的進展[6]。目前，已從多種植物中克隆了CAD基因，如煙草(Nicotianatabacum)[7]、茶(Camelliasinensis)[8]、鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)[9]、楊樹(Populustomentosa)[10]、高粱(Sorghumbicolor)[11]、馬尾松(Pinusmassoniana)[12]、棉花(Gossypiumhirsutum)[13]等，但尚未見巨龍竹CAD基因克隆的相關報道。

巨龍竹(Dendrocalamussinicus)分布于云南省的南部與西南部，賈良智等于1982年在西雙版納首次發(fā)現(xiàn)并命名[14]，為禾本科竹亞科牡竹屬大型合軸型叢生竹類，是云南特有的珍稀竹種，其稈高達30 m，胸徑可達30 cm以上，是迄今全世界發(fā)現(xiàn)的最高大的竹子。根據(jù)基部竹稈形態(tài)的不同，巨龍竹可分為“通直”與“歪腳”兩種稈形[15]。作為稈形最大的工業(yè)用材竹種，巨龍竹具有體積大、生長快、竹壁厚、抗壓力強、通直度好以及不受用材限制等優(yōu)點，可以作為建筑、引水管道、制漿造紙等用材，有著巨大的經濟開發(fā)價值和廣闊的應用前景[16][17]。自巨龍竹被發(fā)現(xiàn)以來，許多學者對其生物學特性、繁育技術、竹材理化性質及用途和遺傳多樣性等方面進行了研究[18]。

本研究首次從巨龍竹中克隆出木質素合成途徑起關鍵作用的肉桂醇脫氫酶基因DsCAD，并對其進行生物信息學分析，為研究巨龍竹的木質素生物合成奠定了基礎，同時為利用基因工程技術調控木質素合成以生產優(yōu)質巨龍竹用材提供靶向基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

巨龍竹分子樣本采于云南省普洱市云興園藝有限公司苗圃基地，分別剪取當年生巨龍竹的竹筍、竹稈、竹葉組織，立即放入液氮中速凍備用?？寺≡噭┖衟ESY-T3及感受態(tài)細胞Trans1-T1購于全式金公司； LA-Taq酶、First cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物工程有限公司；TRIzol試劑購自普洛麥格公司， Tiangen2×Taq酶購自天根生化科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巨龍竹肉桂醇脫氫酶基因的克隆 使用DNAMAN軟件分析NCBI數(shù)據(jù)中的肉桂醇脫氫酶(CAD)基因序列的保守區(qū)域，以保守序列為模板，通過Blast技術對巨龍竹轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選出可能存在的肉桂醇脫氫酶基因序列，根據(jù)篩選的CAD序列，設計特異引物DsCAD-F和DsCAD-R(見表1)。根據(jù)TRIzol試劑操作步驟提取巨龍竹莖稈組織的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠檢測其質量，根據(jù)First cDNA Synthesis Kit操作說明，合成cDNA第一鏈。以巨龍竹莖稈的cDNA第一鏈為模板，DsCAD-F和DsCAD-R為引物，擴增巨龍竹CAD基因片段。擴增條件(50μL)為10×LA Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，DsCAD-F 1μL，DsCAD -R 1 μL，cDNA 3 μL，TaKaRa LA Taq 1 μL，ddH2O 35 μL。擴增條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4℃結束反應后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增的PCR產物經回收純化后連接到pEASY-T3載體，轉化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，然后涂布在含有AMP抗性的LB固體平板培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑選克隆，接種到0.5 mL液體培養(yǎng)基中， 37℃震蕩培養(yǎng)12 h后，菌落PCR檢測陽性克隆插入片段，將有預期插入片段的陽性克隆送上海生工檢測，測序結果用Conting Express軟件進行全長序列拼接以獲得巨龍竹CAD基因的完整序列。

表1 文中PCR所用引物序列

1.2.2 巨龍竹CAD基因的生物信息學分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://web.expasy.org/protparam)的Blast工具、DNAMAN等軟件對克隆得到的巨龍竹CAD與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他植物CAD編碼蛋白的氨基酸序列進行同源性分析及多重序列比對，其蛋白質理化特性通過ExPASy的Protparam在線工具( )進行分析，并利用ProtScale在線軟件(http://web.expasy.org/protscale/)對其親疏水性做進一步分析，使用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP4.0在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析其跨膜結構和肽信號，在線軟件Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測其二級結構，SWISS-MODEL在線工具(http://swissmodel.expasy.org/)對其進行同源三級結構建模，最后運用MEGA7軟件的Neighbor-joining(鄰位相連)算法以1000次boot straping檢驗繪制系統(tǒng)進化樹。

圖1 巨龍竹DsCAD基因克隆PCR擴增Fig.1 PCR amplified product of the DsCAD gene clone M: 1k DNA marker (Takara)

1.2.3 巨龍竹不同組織DsCAD的實時熒光定量(Real time PCR)表達分析 按照SGTriEx 高純總RNA提取試劑盒方法分別提取竹筍、竹稈、竹葉組織的RNA。采用First cDNA Synthesis Kit試劑盒獲得cDNA第一鏈。以各組織的cDNA為模板、TDsCAD-F和TDsCAD-R為引物(表1)，采用Real time PCR的方法檢測DsCAD在巨龍竹的筍、莖、葉3個不同組織的表達情況。Real time PCR反應試劑用2×SG Green qPCR Mix，以tubulin為內參基因，PCR擴增引物為Dstubulin-F和Dstubulin-R(見表1)。PCR反應體系15 μL，反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 20 s；60℃ 30 s，72℃ 25 s，35個循環(huán)，72℃單點檢測信號。反應結束后，60℃連續(xù)檢測信號產生溶解曲線。用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，每個樣品3次重復，滅菌水對空白對照。

2 結果與分析

2.1 巨龍竹DsCAD基因克隆

使用特異引物DsCAD-F和DsCAD-R，以巨龍竹莖稈的cDNA為模板， 利用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法擴增得到一條全長1 080 bp的基因片段(見圖1)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具對其測序結果進行了序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段包含起始密碼子ATG和終止密碼子GTA在內的完整cDNA開放閱讀框(ORF)，編碼359個氨基酸，將其命名為DsCAD。

圖2 巨龍竹CAD與其他植物CAD多重序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of the DsCAD and other plant CAD amino acid sequences

2.2 巨龍竹DsCAD基因的生物信息學分析

2.2.1 DsCAD氨基酸序列分析及多重序列比對 使用NCBI的Blast工具對克隆到的DsCAD編碼的蛋白質氨基酸序列進行分析，并利用DNAMAN軟件將DsCAD氨基酸序列與4種植物的CAD氨基酸序列進行多序列比對，4種植物分別為孝順竹(Bambusamultiplex，登錄號為ADG02378)、玉米(Zeamays，登錄號為NP_001105654)、小麥(Triticumaestivum，登錄號為ADI59734)、短花藥野生稻(Oryzabrachyantha，登錄號為XP_006647011)，結果見圖2。分析發(fā)現(xiàn)DsCAD蛋白N端包含兩個Zn2+結合點位(BoxⅠ和BoxⅡ，圖2)和1個NADP(H)輔酶結合點位(BoxⅢ，圖2)，這些結構域存在于CAD超家族中，是CAD蛋白共同的保守結構域，表明DsCAD屬于CAD蛋白家族[19]。經氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，DsCAD氨基酸序列與孝順竹、玉米、小麥、短花藥野生稻CAD氨基酸序列的一致性分別達到95%、90%、88%、92%，進一步證實克隆得到DsCAD基因為CAD基因。

2.2.2 DsCAD編碼蛋白質理化性質及結構預測 利用ExPASy在線工具Protparam分析DsCAD蛋白質理化特性，預測其理論相對分子質量為38 689.6，理論等電點為6.18，親水性總平均值為0.055，預測該蛋白的應為疏水性蛋白。使用ExPASy在線工具ProtScale進一步分析DsCAD編碼的蛋白的親疏水性，預測結果顯示其為疏水性蛋白，與Protparam工具預測結果一致。TMHMM在線分析DsCAD蛋白顯示，發(fā)現(xiàn)其不具有跨膜結構，同時利用SignalP4.0在線工具分析發(fā)現(xiàn)其不包含信號肽序列，說明該蛋白應定位于細胞質基質中，不屬于膜蛋白或分泌蛋白。使用在線軟件Psipred預測DsCAD蛋白的二級結構，其中無規(guī)則卷曲約59.89%，β-折疊約為22.84%，α-螺旋約占17.27%。SWISS-MODEL在線工具以擬南芥肉桂醇脫氫酶AtCAD5蛋白的晶體結構為參考模板，對DsCAD蛋白進行同源三級結構建模(圖3)，二者的蛋白序列同源性達72.39%。在擬南芥的CAD基因家族中，只有AtCAD4和AtCAD5對木質素的合成起關鍵作用[20]，據(jù)此推測DsCAD應具備與AtCAD5相似的催化功能。

圖3 巨龍竹DsCAD蛋白質三維結構預測Fig.3 Three-dimensional structure prediction of DsCAD

2.2.3 DsCAD基因系統(tǒng)進化樹分析 利用MEGA7軟件將DsCAD與擬南芥9個CAD基因以及其他9種植物的CAD基因編碼的氨基酸序列進行比對，用Neighbor-joining算法構建CAD基因系統(tǒng)進化樹(圖4)，構建進化樹所選用的CAD氨基酸序列的NCBI登錄號分別為擬南芥Q9CAI3(AtCAD1)、Q9SJ25(AtCAD2)、Q9SJ10(AtCAD3)、P48523(AtCAD4)、O49482(AtCAD5)、O65621(AtCAD6)、Q02971(AtCAD7)、Q02972(AtCAD8)、P42734(AtCAD9)，青蒿(Artemisiaannua)ACB54931，孝順竹(Bambusamultiplex)ADG02378，油棕(Elaeisguineensis)XP_010943210，烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)EMS63282，芒草(Miscanthussinensis)ALE20537，川桑(Morusnotabilis)XP_010096287，煙草(Nicotianaattenuata)AFP43764，銀合歡(Leucaenaleucocephala)ACG58885，黃瓜(Cucumissativus)XP_004140716。

圖4 巨龍竹與其他植物CAD系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the DsCAD and other plants on CADs

CAD編碼基因在多種植物體內存在基因家族，不同CAD同工酶在催化肉桂醛的生成肉桂醇的過程中表現(xiàn)出不同的活性，如擬南芥的9個CAD基因中只有AtCAD4和AtCAD5在木質素合成中起重要作用[21]。系統(tǒng)進化分析顯示，DsCAD及其他9種植物的CAD蛋白與擬南芥AtCAD4和AtCAD5聚為一支(subgroupⅢ，圖4)，而與擬南芥其他CAD亞型(subgroupⅠ和subgroupⅡ，圖4)親緣關系較遠，表明DsCAD與AtCAD4、AtCAD5在木質素合成中的功能相似，對巨龍竹木質素生物合成起著重要作用。在系統(tǒng)進化分支subgroupⅢ中，DsCAD又與油棕、烏拉爾圖小麥、芒草、孝順竹等單子葉植物聚為一類，表明它們的親緣關系較近，其中與孝順竹、芒草等禾本科植物親緣關系更近；而擬南芥、青蒿、煙草、川桑、銀合歡、黃瓜等與巨龍竹親緣關系較遠的雙子葉植物則聚為另一類。

圖5 巨龍竹DsCAD不同組織表達Fig.5 Real time PCR detection of the DsCAD in shoots, culms and leaves in Dendrocalamus sinicus

2.3 DsCAD在巨龍竹不同組織中的表達分析

采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法，以特異引物DsCAD-F和DsCAD-R檢測DsCAD在巨龍竹的筍、莖稈和葉3個組織中的表達情況(結果見圖5)。圖5顯示DsCAD基因在巨龍竹3個組織中表達量有所不同。竹筍中的表達量最高，莖稈中的表達量次之，在葉中的表達量最低。由DsCAD這種組織表達量的變化，可以推測巨龍竹為滿足其巨大以及生長快速的特性，在竹筍期間已經合成大量的木質素以支撐整個高大植株的生長，而莖稈的木質化過程則相對緩慢些。

3 結論與討論

肉桂醇脫氫酶作為植物木質素合成中重要的限速酶，可以將不同的肉桂醛轉化成相應的肉桂醇，從而影響木質素的形成與結構，是調控木質素合成的理想控制點[22]。目前，已有調控CAD基因以降低植物植株的木質素含量或改變其組成結構以利于降解的報道，如對煙草和楊樹的CAD基因反義抑制顯示，其木質素含量變化很小，但組成結構發(fā)生很大變化，更有利于木質素的抽取[23]；通過抑制4CL基因表達來獲得低木質化的玉米[1]、挪威云杉(Piceaabies)[24]等轉基因植株。此外，由于可以與高分子產生較強的分子間作用力，利用木質素制備高強度復合材料成為近年來的研究熱點，這些研究為利用基因工程增加工業(yè)用材植物的木質素含量或改造組分增加其強度，從而為生產環(huán)保的建筑材料等產品提供了一些啟示[25]。

巨龍竹因其特有的稈材優(yōu)異性，被視為最具科學研究價值和開發(fā)利用潛力的經濟用材竹種之一，在人造板材、制漿造紙和生物煉制等領域表現(xiàn)出極高的開發(fā)研究價值，其中通直型巨龍竹還是特大型工業(yè)用材的優(yōu)良竹種[26]。巨龍竹分布的滇西南和滇南地區(qū)為傣族、佤族、拉祜族等少數(shù)民族聚居的邊疆地區(qū)，合理開發(fā)利用巨龍竹發(fā)展竹產業(yè)，有利于提高當?shù)亟洕l(fā)展水平、改善生態(tài)環(huán)境[27]。

本研究運用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法從巨龍竹莖稈中克隆得到肉桂醇脫氫酶DsCAD，其包含1080 bp完整的cDNA開放閱讀框，編碼359個氨基酸；利用生物信息學軟件對其進行序列分析、多重氨基酸序列比對、理化性質分析、結構預測及系統(tǒng)進化分析，確定DsCAD為巨龍竹木質素合成中有重要作用的CAD基因，為深入研究巨龍竹木質素的合成機制奠定基礎，也為利用基因工程技術調控巨龍竹的木質素合成，生產優(yōu)質巨龍竹用材及造紙原料提供靶向基因。

[1] Fornalé S, Capellades M, Encina A, et al. Altered lignin biosynthesis improves cellulosic bioethanol production in transgenic maize plants down-regulated for cinnamyl alcohol dehydrogenase[J]. Molecular Plant, 2012, 5(4): 817-830.

[2] 谷振軍. 赤桉木質素單體合成途徑的基因家族研究[D]. 中南林業(yè)科技大學, 2014.

[3] 胡可, 嚴雪鋒, 栗丹, 等. 沉默CCR和CAD基因培育低木質素含量轉基因多年生黑麥草[J]. 草業(yè)學報, 2013, 22(5): 72-83.

[4] 郭光艷, 柏峰, 劉偉, 等. 轉錄因子對木質素生物合成調控的研究進展[J]. 中國農業(yè)科學, 2015, 48(7): 1277-1287.

[5] Pandey B, Pandey V P, Dwivedi U N. Cloning, expression, functional validation and modeling of cinnamyl alcohol dehydrogenase isolated from xylem of Leucaena leucocephala[J]. Protein expression and purification, 2011, 79(2): 197-203.

[6] 曹佳強, 李波, 楊洋, 等.木質素生物合成中肉桂醇脫氫酶基因(CAD)的研究進展[J]. 分子生物育種, 2014, 12(5): 1034-1043.

[7] Knight M E, Halpin C, Schuch W. Identification and characterization of cDNA clones encoding cinnamyl alcohol dehydrogenase from tobaco[J]. Plant Molecular Biology, 1992, 19(5): 793-801.

[8] Deng W W, Zhang M, Wu J Q, et al. Molecular cloning, functional analysis of three cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) genes in the leaves of tea plant, Camellia sinensis[J]. Journal of plant physiology, 2013, 170(3): 272-282.

[9] Sun Y, Wu Y, Zhao Y, et al. Molecular cloning and biochemical characterization of two cinnamyl alcohol dehydrogenases from a liverwort Plagiochasma appendiculatum[J]. Plant physiology and biochemistry, 2013, 70: 133-141.

[10] 任珊珊, 趙艷玲, 白華, 等. 楊樹肉桂醇脫氫酶基因序列和表達模式分析及CAD4酶活性檢測[J]. 華中農業(yè)大學學報, 2011, 30(5): 578-584.

[11] 王麗華, 李杰勤, 詹秋文, 等. 高粱 SbCAD4 基因的克隆與序列分析及原核表達分析[J]. 湖南農業(yè)大學學報: 自然科學版, 2015, 41(6): 595-601.

[12] 張逢凱, 潘婷, 盛璐, 等. 馬尾松 CAD 基因的克隆及其編碼蛋白質的結構預測[J]. 分子植物育種, 2014, 12(4): 638-645.

[13] 倪志勇, 李波, 范玲. 棉花肉桂醇脫氫酶基因 GhCAD3 的克隆及原核表達[J]. 核農學報, 2010 (5): 910-916.

[14] 賈良智, 孫吉良. 我國發(fā)現(xiàn)巨龍竹[J]. 竹類研究, 1982, 1 (1): 10.

[15] 谷志佳, 楊漢奇, 孫茂盛, 等. 巨龍竹資源分布特點及其開花結實現(xiàn)象[J]. 林業(yè)科學研究, 2012, 25(1): 1-5.

[16] 吳謹會, 譚宏超. 巨龍竹的生長發(fā)育規(guī)律及播種育苗技術[J]. 云南林業(yè), 2006, 27(6): 21-22.

[17] 普曉蘭, 杜凡. 巨龍竹纖維形態(tài)及變異規(guī)律的研究[J]. 云南林業(yè)科技, 2003 (1): 1-4.

[18] 劉世男, 輝朝茂. 珍稀竹種巨龍竹的研究現(xiàn)狀和展望[J]. 世界竹藤通訊, 2011 (5): 26-30.

[19] 張魯斌, 谷會, 弓德強, 等. 植物肉桂醇脫氫酶及其基因研究進展[J]. 西北植物學報, 2011, 31(1): 204-211.

[20] Kim S J, Kim M R, Bedgar D L, et al. Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(6): 1455-1460.

[21] 龔琰, 許夢秋. 木質素合成關鍵酶——肉桂醇脫氫酶的研究進展[J]. 生物技術通報, 2010, 4: 47-49.

[22] 陳博雯, 蔣華, 覃鵬飛, 等. 尾葉桉 GLU4 無性系肉桂酰乙醇脫氫酶基因克隆及序列分析[J]. 西部林業(yè)科學, 2014, 43(2): 19-24.

[23] 孔華, 郭安平, 郭運玲, 等. 木質素生物合成及轉基因調控研究進展[J]. 熱帶農業(yè)工程, 2009, 33(5): 47-53.

[24] 陳永忠. 低木質素轉基因挪威云杉的植株再生及功能基因表達的微陣列檢測[D]. 中南林學院, 2002.

[25] 馬艾麗. 木質素高值化材料的制備與應用性能研究[D]. 華南理工大學, 2014.

[26] 史正軍. 甜龍竹及巨龍竹半纖維素, 木質素結構詮釋及相互間化學鍵合機制解析 [D][D]. 北京林業(yè)大學, 2013.

[27] 孫茂盛, 湯成松, 楊宇明, 等. 特有珍稀竹種巨龍竹種子育苗技術[J]. 世界竹藤通訊, 2013 (1): 22-25.

Cloning and Functional Analysis of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene fromDendrocalamussinicus

SUN Jin-jin1,2, ZHU Jin-xin1,2, WANG Juan2,3,YANG Yu-ming2,3, WANG Yi2,3

(1.Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan, China；2.The Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration，Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201，Yunnan, China；3.The Key Laboratory of Forest Plants Cultivation and Utilization，Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201，Yunnan, China)

Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) is one of the key enzymes in lignin biosynthesis. In this study, a CAD gene (designated as DsCAD) was obtained from the culm ofDendrocalamussinicusby RT-PCR with a pair of special primers designed based on the transcriptome date. The DsCAD gene has a 1080bp open reading frame (ORF) that is predicted to encode a protein of 359 amino acids with predicted molecular mass of 38689.6 and a basic isoelectric point of 6.18. DsCAD gene was analyzed by bioinformatics tools. The results showed that the DsCAD encoding sequence has the conserved domain of CAD superfamily and it has typical characteristics of CAD genes in plants.Dendrocalamussinicushas more closer relative relationship with Poaceae plants and the DsCAD sequence shared high sequence identity(95%) withBambusamultiplex. Real time PCR analysis showed that the DsCAD was most strongly expressed in the shoots. This result will provide useful information for lignins biosynthesis research ofDendrocalamussinicusin future.

Cinnamyl alcohol dehydrogenase;Dendrocalamussinicus; Gene clone; Real time PCR

2016-03-21

云南省對外科技合作計劃(2014IA3)；云南省基礎研究重點項目(2013FA054)；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養(yǎng)項目(2010CI016)

孫金金(1986-)，女，碩士研究生，主要從事植物地理學研究。通信作者：王毅(1981-)，男，助理研究員，博士，主要從植物分子生物學研究。E-mail：228285818@qq.com