郭晶瑩，張紅萍

異丙醇/鹽雙水相分離制備高色價梔子黃

郭晶瑩，張紅萍

（邵陽學院生物與化學工程系，湖南 邵陽 422000）

采用異丙醇/鹽組成的雙水相體系分離梔子黃。綜合考察了鹽的種類、濃度、pH值和溫度等因素對梔子黃分離效果的影響，并且采用紫外-可見分光光度法和HPLC對異丙醇/鹽雙水相體系分離得到的梔子黃進行評價。結(jié)果表明，在35℃條件下由1.6g的檸檬酸三鈉和2mL的異丙醇組成雙水相體系，pH等于8.7，分離得到梔子黃和OD值分別為0.382、542。

梔子黃；分離；雙水相

Gardenia jasminoides Ellis（Rubiaceae）的中文名字是梔子，是一種藥食同源的藥材。梔子中的主要成分是梔子苷和梔子黃，現(xiàn)代藥理學研究表明梔子中的梔子苷具有多種藥理作用，例如抑制肝硬化、降低血糖、預防動脈硬化和緩解失眠等［1-3］。梔子黃包括藏花素-1、藏花酸和少量的梔子苷，其中藏花素-1是藏花酸與單糖和二糖形成的酯類化合物，它是梔子黃中的主要成分。梔子黃是一種天然色素，廣泛用于食品染色和染料敏化太陽能電池中［4］。到目前為止，從梔子中分離純化梔子黃的方法有超臨界CO2、結(jié)晶、色譜以及大孔樹脂吸附等［5-8］。但是，這些方法存在耗時、生產(chǎn)成本高、操作繁瑣等缺點。因此，需要建立一種簡單有效的方法，低成本、高效率地從梔子中分離梔子黃。

自從Albertson首次引用雙水相技術(shù)（ATPE）后，雙水相技術(shù)就作為一種高效的分離方法運用到了生物活性成分的分離中，例如蛋白質(zhì)、酶和抗生素的分離［9-11］。經(jīng)典雙水相體系是由兩種互不相溶的高聚物或一種高聚物與一種無機鹽組成，通過使用ATPE，可以得到高純度和高收率的目標產(chǎn)物，并且不會破壞目標產(chǎn)物的生物活性。最近Pan使用傳統(tǒng)的ATPS從梔子中成功分離得到梔子苷。這個雙水相體系是由20%的環(huán)氧乙烷和80%的氧化丙烯、KH2PO4和乙醇組成的［12］。相對于高聚物/鹽形成的雙水相，短鏈醇/親水溶劑組成的雙水相體系具有以下的優(yōu)點：低黏度，分相速度快，溶劑可以循環(huán)使用，低毒性。在異丙醇/鹽ATPS中，異丙醇-K3PO4-H2O體系被成功用于人尿液中睪酮和表睪酮的分離提?。?3］。目前為止，還沒有使用異丙醇/鹽雙水相體系分離梔子黃的報道。

本試驗以異丙醇/鹽組成的雙水相體系進行梔子黃的分離，討論了鹽的種類、濃度、pH值和溫度等因素對梔子黃分離效果的影響。

1 實驗材料

1.1 化學藥品及試劑

梔子苷標準品（99.8% HPLC），藏花素-1（梔子黃，99.5%，HPLC），異丙醇，分析試劑鹽，其它用于試驗和檢測的藥物均是分析純試劑。實驗用水都是去離子水。C-18（SPD，日本）用于HPLC分析檢測，分析檢測過程中使用的溶劑是高效液相層析級溶劑。

2 實驗方法

2.1 梔子果的粗提取液

從當?shù)厮幍曩徺I干燥的梔子果實。將梔子果研磨干燥，過0.42mm的金屬篩，最終得到梔子果粉（500g）。采用索氏提取法，以石油醚（沸點60～90℃）為溶劑，去除果粉中的一部分多糖，然后將得到的果粉，用40%（4L）的乙醇冷凝回流2次，最終將乙醇提取液混合濃縮到1.0L，粗提取液在4℃條件下保存，備用。

2.2 雙水相體系的建立

采用濁點法繪制異丙醇-鹽雙水相圖［14］。實驗操作如下：在15mL的離心管中，加入一定量的異丙醇，直至體系恰好形成渾濁，然后再滴加適量的水，使體系恰好形成渾濁。記錄每個濁點時，異丙醇的添加量和體系的總質(zhì)量。

2.3 雙水相體系中分離梔子黃

為了考察雙水相體系組成、鹽的添加量、體系的溫度和pH值對梔子黃分離效果的影響，進行如下實驗：取1mL梔子果粉的粗提取物（1g·mL-1）添加到雙水相體系中，在磁力攪拌下充分混合，然后靜置40min，分離上下相，測量上下相的體積，使用紫外分光光度計測量上下相中梔子黃的含量。

2.4 分析方法

2.4.1 工作曲線的繪制

藏花素-1是梔子黃混合物中含量最高的色素，所以選用它作為衡量梔子黃含量的標準。測量不同濃度的藏花素-1在440 nm處的吸光度，繪制梔子黃的標準曲線見圖1。

圖1 梔子黃標準曲線Fig.1 The calibration curve of gardenia yellow

2.4.2 分配系數(shù)

梔子黃的分配系數(shù)（K）采用公式（1）計算：

式中，CT和CB分別是相平衡時梔子黃在上相和下相的濃度。

2.4.3 梔子黃的收率

式中，VT和VB分表代表上下相的體積。

2.4.4 梔子黃色價的測量

梔子黃的色價采用GB 7912-2010的標準要求進行測量。具體操作如下：取0.015g的梔子黃標準品溶解在去離子水中，然后將溶液轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容；取1mL的液體，將其轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容；用UV-2600紫外可見分光光度計測量梔子黃在440nm的吸光度（吸光度應(yīng)控制在0.3～0.7）。梔子黃的色價和OD值的計算采用下述公式：

式中，E是梔子黃的色價，A是溶液在440nm處的吸光度，C是稀釋后的梔子黃的濃度，g·mL-1。2.4.5 HPLC分析

用LC-20A的HPLC（二極管陣列檢測器和C18色譜柱，4.6nm×250nm，5μm）檢測藏花素-1。流動相是甲醇（溶劑A）和水（溶劑B，含有0.1%醋酸）。按如下比例進行洗脫：0～4min，20% A；4～40min，20%～90% A。 流 速：1.00mL·min-1；檢 測 波 長440nm；進樣量：10μL；柱溫30℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽的種類和用量對雙水相體系的影響

為了選擇一個最佳的雙水相體系，在室溫下，研究了不同的鹽（磷酸氫二鉀、硫酸銨、檸檬酸三鈉、碳酸鉀）和異丙醇形成的雙水相體系對梔子黃的分離效果，結(jié)果如表1所示。當使用2mL的異丙醇與鹽形成的雙水相，加入的粗提取液的體積是1.0mL時，這4種鹽對梔子黃的提取率影響有所不同。實驗結(jié)果顯示，當鹽的含量增加時，梔子黃在上相的K和Y都隨之增加。造成這一結(jié)果的主要原因是：隨著鹽含量的增加，高濃度的鹽引起鹽析作用，導致上相異丙醇含量升高，由此可以看出梔子黃易溶于異丙醇中。從表1可以看出，異丙醇-硫酸銨和異丙醇-檸檬酸三鈉對梔子黃色素回收率的影響相近。使用2.0g的硫酸銨形成雙水相，梔子黃在上相的分配系數(shù)和回收率分別是15.11和87.17%。對于2.0g的檸檬酸三鈉形成的雙水相體系，梔子黃的分配系數(shù)和回收率分別是13.87和86.44%。從環(huán)保的角度來說，使用檸檬酸三鈉比硫酸銨更合適，因為硫酸銨易引起湖泊的富營養(yǎng)化，而檸檬酸三鈉則可以被生物降解，對環(huán)境污染較小。因此，異丙醇-檸檬酸三鈉更適合用于梔子黃在上相的富集，同時，粗提取液中含有的其它成分進入到雙水相的下相。基于上述事實，后續(xù)的試驗選用2g的檸檬酸三鈉與異丙醇形成的雙水相作為梔子黃的分離體系。

表1 不同鹽形成的雙水相體系對梔子苷和梔子黃富集體系的影響Table 1 Extraction of gardenia yellow using differrent isopanol/salt ATPS

3.2 溫度對雙水相體系的影響

為了考察溫度對梔子黃分離效果的影響，本試驗考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下梔子黃的分離效果，其它實驗均設(shè)在上述的最佳實驗條件下，實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，梔子黃在上相的收率隨著溫度的升高而升高。但是，在20～40℃范圍內(nèi)，梔子黃在上相的收率變化都在80%左右。由此可見，溫度對梔子黃分離效果的影響很小。接下來的實驗都在室溫下進行。

3.3 pH對雙水相體系的影響

圖2 溫度對梔子黃收率的影響2.0mL isopropanol， 2g sodium citrate and 1.0mL crude xtracts of gardenia fruitsFig.3 Effect of temperature on the recovery of gardenia yellow

為了確定分離梔子黃的最佳雙水相體系，需要考察pH值對梔子黃分離效果的影響。采用不同體積比例的0.1mol·L-1HCl和0.1mol·L-1NaOH，調(diào)節(jié)體系上相的pH值，使pH在2～12之間，而其它的參數(shù)均為上述得到的最佳參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 pH對梔子黃分離效果的影響Table 2 Effect of pH on gardenia yellow partition behavior using isopropanol/ sodium citrate ATPS

由表2可知， 隨著體系pH值的改變，梔子黃在上相的收率有一個很小的波動，但是收率基本在82%～85%之間變化。

3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取影響梔子黃提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，對結(jié)果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9（34）正交表，以檸檬酸三鈉（A）、溫度（B）、pH（C）作為3個考察因素，選取3個水平進行試驗。

表3 異丙醇-檸檬酸三鈉分離梔子黃工藝L9（34）正交實驗因素水平表Table3 Factors and levels for L9（34） orthogonal design

表4 異丙醇-檸檬酸三鈉提取梔子黃工藝L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table4 L9（34） orthogonal design and results

由表4的極差分析結(jié)果看出，這3個因素對異丙醇-檸檬酸三鈉分離梔子黃的影響大小依次為：檸檬酸三鈉的添加量（A）＞溫度（B）＞pH（C）。3個因素中，檸檬酸三鈉和溫度的影響較為顯著，其中，檸檬酸三鈉的添加量對分離效果影響最為顯著。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到分離梔子黃的最佳試驗條件為A2B3C3，即檸檬酸三鈉1.6g，提取溫度35℃，pH值為8.7。

3.5 雙水相分離梔子黃效果評價

取等體積的梔子黃粗提取液，按照上述最佳試驗結(jié)果提取梔子黃，對得到的梔子黃進行HPLC分析（檢測波長440nm，檢測器：紫外檢測器）。從HPLC分析（圖3）可以看出，梔子黃標準品的保留時間為21.2min，經(jīng)過雙水相分離得到的梔子黃的保留時間也在21.2min，產(chǎn)物的純度達到87.6%。采用紫外分光光度法測定雙水相體系中上相的梔子黃含量，通過梔子黃的標準曲線和梔子黃色價的計算方法得到的梔子黃的色價是542，OD值是0.382。與通過部分傳統(tǒng)方法得到的梔子黃的色價和OD值相比，此色價和OD值較好。由此可以看出，ATPE可以用于梔子黃的提取。

圖3 HPLC分析a. crocin-1 reference substance； b. fraction into gardenia yellow after ATPEFig.3 HPLC chromatograms with UV detection at 440nm

4 結(jié)論

本實驗探究了梔子黃在異丙醇-檸檬酸三鈉體系中的分配情況。正交實驗結(jié)果表明，在35℃條件下，1.6g檸檬酸三鈉和2mL的異丙醇，在pH=8.7的條件下，梔子黃更容易富集于上相，而多糖等雜質(zhì)則富集于下相。相比傳統(tǒng)的分離方法，異丙醇-檸檬酸三鈉雙水相萃取得到的梔子黃，具有很高的色價和OD值。

運用此雙水相體系分離梔子黃，不僅降低了分離梔子黃的成本，還縮短了分離時間。該體系在分離梔子黃色素中的成功應(yīng)用，不僅拓寬了異丙醇-鹽雙水相體系的應(yīng)用范圍，也為梔子黃的分離提供了新的方法和思路。

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Abstrat：Gardenia yellow was separated by employing isopropanol-salt aqueous two-phase system. The factors such as kinds of salt，concentration of the salt， pH and temperture on the gardenia yellow separation efficiency were investigated， and the gardenia yellow was analyzed by spectrophotometric method and HPLC. The results showed that the aqueous two-phase system which was formed by isopropanol alcohol（2mL） and sodium citrate （1.6g）was effective for the separation of gardenia yellow from gardenia fruit in 35℃ and pH=8.7，and the color value and the OD of the gardenia yellow were 542 and 0.382，respectively.

Separation of Gardenia Yellow by Isopropanol Alcohol/Salt Aqueous Two-Phase System

GUO Jing-ying ，ZHANG Hong-ping
（Department of Chemistry and Biology Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

gardenia yellow； separation； aquous two phase system

TS 202. 3

A

1671-9905（2016）03-0007-05

邵陽市科技局科研項目（2015GX38）；邵陽學院研究生科研創(chuàng)新項目（CX2015SY035），

郭晶瑩（1987-），女，河南許昌人，邵陽學院2014級碩士研究生，研究方向：食品安全
通訊聯(lián)系人：張紅萍（1973-），女，漢族，湖南邵陽人，教授，主要從事有機合成研究。E-mail： zhp4901@163.com

2016-01-13