熊建華,余升強,朱紅祥,王雙飛

(1.廣西大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 廣西南寧530004； 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院， 廣西南寧530004；3.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室, 廣西南寧530004)

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超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣的研究

熊建華,余升強1,朱紅祥2,3,王雙飛2,3

(1.廣西大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 廣西南寧530004； 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院， 廣西南寧530004；3.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室, 廣西南寧530004)

摘要：為了提高蔗渣的酶解產(chǎn)糖率，利用超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣。堿處理的單因素實驗和超聲波輔助堿的正交試驗表明，超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣最佳參數(shù)為：堿的最佳濃度為1%、最佳處理時間為60 min、最佳處理溫度為80 ℃。在超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣最佳條件下，酶解產(chǎn)糖率的單因素實驗最佳條件為：酶解最佳時間為30 h，最佳酶用量為6.0 FPU，最佳酶解溫度為50 ℃。超聲波輔助NaOH預(yù)處理蔗渣是一種能有效降低預(yù)處理溫度，提高酶解產(chǎn)糖量，提高物料的可及性，提升生產(chǎn)效率，降低纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇生產(chǎn)成本的預(yù)處理方法。

關(guān)鍵詞：超聲波；堿預(yù)處理；最佳參數(shù)；蔗渣

0引言

甘蔗渣屬于非木材纖維，它是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)品，具有來源集中、產(chǎn)量巨大、收集簡單、運輸半徑小等優(yōu)點，是一種十分優(yōu)質(zhì)的可再生性農(nóng)業(yè)廢棄物資源。隨著地球上不可再生資源煤、石油、天然氣等日益消耗, 將天然木質(zhì)纖維素如甘蔗渣等轉(zhuǎn)化得到乙醇等可再生能源日益成為當(dāng)前研究的熱點，因此蔗渣的高效利用是一個重要的研究課題[1-3]。

蔗渣最主要的成分是纖維素，其次是木質(zhì)素和半纖維素，其中纖維素占 32%～48%、木質(zhì)素占 23%～32%、半纖維素占19%～24%、蛋白質(zhì)約2%、灰分約4%，成分相對穩(wěn)定，性質(zhì)均一[4-6]。由于纖維素自身的結(jié)晶結(jié)構(gòu)及木質(zhì)素、半纖維素對它的保護作用，使反應(yīng)試劑難以到達纖維素表面和擴散入纖維素內(nèi)部，因此若要充分利用纖維素生物資源，就需要對其進行有效的預(yù)處理[7-9]。NaOH預(yù)處理對纖維物料的化學(xué)組成比例有很大影響，經(jīng)過NaOH預(yù)處理過的植物纖維物料中的纖維素明顯潤脹，結(jié)晶度降低，纖維素內(nèi)部受到破壞，所以NaOH 預(yù)處理是一種有效的植物纖維原料預(yù)處理方法，經(jīng) NaOH 預(yù)處理后的物料更易于酶解[10]。利用超聲波的聲空化作用，使纖維素表面和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)受到損害，形態(tài)結(jié)構(gòu)破碎，變得松散，使纖維表面積增加，提高植物纖維可接觸性和反應(yīng)活性，促進纖維水解產(chǎn)生更多的還原糖[11-14]。

目前有許多學(xué)者對蔗渣等生物能源的開發(fā)進行研究。覃益民等[15]用超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣的研究，發(fā)現(xiàn)采用超聲波輔助堿預(yù)處理的方法可以明顯提高蔗渣酶解糖化活性。Chosdu等[16]研究表明，采用電子束照射輔助2%NaOH處理玉米秸稈等，酶解后葡萄糖得率提高13%。徐國濤[17]以玉米秸稈為原料，對其進行超聲波輔助處理后纖維素酶水解的綜合預(yù)處理，以提高玉米秸稈產(chǎn)氣能力。但是大多數(shù)研究卻沒有探討提高預(yù)處理能力的具體工藝參數(shù)，而有效的預(yù)處理是纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的關(guān)鍵，對提高物料的可及性，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本具有重大的實際指導(dǎo)意義。本文為了提高蔗渣的酶解產(chǎn)糖率，在原有堿預(yù)處理蔗渣的研究基礎(chǔ)上，引入超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣的研究，通過單因素對堿處理蔗渣最優(yōu)條件的研究，利用正交試驗研究超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣提高酶解產(chǎn)糖率的最優(yōu)工藝條件，并使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR-8400S)對預(yù)處理前后蔗渣內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化進行分析，旨在為纖維素乙醇生產(chǎn)工藝的預(yù)處理提供最優(yōu)條件提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1實驗材料

實驗中所用到的蔗渣是來自廣西南寧糖廠。經(jīng)過粉碎儀粉碎后過60目篩裝袋備用。

1.1.2實驗主要試劑

氫氧化鈉；硫酸；丙酮；二水合氯化鋇；碘化鉀；酒石酸鉀；3,5-二硝基水楊酸；苯酚；偏重亞硫酸鈉；乙醇；重鉻酸鉀；苯。以上試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3實驗儀器

分析天平(SL502)；紫外可見分光光度計(UV-2802S)；722分光光度計；恒溫水浴振蕩器(SHA-B)；恒溫水浴鍋(HH-S6)；超聲波清洗儀(SK250LH)；離心機(TG16)；電爐；KSW-4D-11型馬弗爐；烘箱；真空泵；傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR-8400S)。

1.2實驗方法

1.2.1堿預(yù)處理單因素實驗

1.2.1.1NaOH濃度

稱取1 g蔗渣，與濃度為0%，0.25%，0.5%，1%，2%，3%的氫氧化鈉溶液均勻混合,取固液比為40，置于100 ℃水浴鍋中靜置60 min。在離心機(4 000 r/min)中離心10 min，將堿預(yù)處理后的蔗渣于烘箱(80 ℃)中烘至恒重。取0.5 g預(yù)處理后的樣品，加入0.01 g纖維素酶(2 000 FPU/g)和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液(pH=4)，在溫度為50 ℃下的恒溫振蕩水槽中酶解24 h。取樣品上清液1 mL于25 mL比色管中，加入DNS試劑1 mL，置于100 ℃沸水浴中水浴5 min，冷卻后用水補足到25 mL刻度，在540 nm波長下測定6個樣品吸光度。

1.2.1.2處理時間

稱取1 g蔗渣，與濃度為1%的氫氧化鈉溶液均勻混合，置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中靜置60 min。其余步驟同1.2.1.1。

1.2.1.3處理溫度

稱取1 g蔗渣，與濃度為1%的氫氧化鈉溶液均勻混合，置于100 ℃水浴鍋中靜置20、40、60、80、100 min。其余步驟同1.2.1.1。

1.2.2超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣提高酶解產(chǎn)糖率工藝的正交試驗

稱取1 g蔗渣，選定超聲波功率為100 W，頻率為40 kHz，堿濃度(0.5%、1%、2%)、處理溫度(80 ℃、90 ℃、100 ℃)、處理時間(30 min、60 min、90 min)，進行正交試驗 L9(33)，編碼表見表1。

表1　因素水平表

1.2.3超聲波輔助堿處理蔗渣酶解單因素實驗

1.2.3.1酶解時間

取1 g蔗渣在NaOH濃度為1%，溫度為80 ℃，處理時間為60 min的條件下進行超聲波處理，處理后的蔗渣離心并洗滌至中性，放于80 ℃烘箱中烘干至恒重，取0.5 g蔗渣加入一定量的纖維素酶水解48 h，并每隔一段時間(5 h)測定其產(chǎn)糖量。

1.2.3.2最適酶用量

稱取6份0.5 g超聲波輔助堿處理過的蔗渣，分別加入FPU為：1、2、4、6、8、10的纖維素酶，25 mL pH=4的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液，放入50 ℃, 120 r/min恒溫水浴振蕩器中酶解30 h。

1.2.3.3最適酶解溫度

稱取6份0.5 g超聲波輔助堿法預(yù)處理過的蔗渣，分別加入6.0 FPU的纖維素酶，一定量pH為4.0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液，放入溫度分別為30，40，50，60，70，80 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫水浴振蕩水器中酶解30 h。

1.3分析方法

1.3.1蔗渣主要成分的測定

甘蔗渣的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的測定方法按文獻[18]進行。

1.3.2還原糖的測定

還原糖量的測定采用 DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[19]。

1.3.3甘蔗渣的紅外分析

取少量未處理、堿處理、超聲波處理后的蔗渣，分別與一定量的KBr粉末研磨混合均勻，壓片法測定，測定范圍為400～4 000 cm-1。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻[19]提供的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸方程為y=0.5184x+0.0419，其中x為葡萄糖量(mg)，y為吸光度；線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 5，在葡萄糖量為0.2～1.2 mg范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

2.2不同NaOH濃度對蔗渣水解產(chǎn)糖的影響

由圖2可以看出， 1 g蔗渣經(jīng)過不同濃度堿處理后，酶解產(chǎn)糖量變化較大，當(dāng)堿濃度為從0%增加到0.5%時，酶解產(chǎn)糖量從0.675 mg增加到9.300 mg，當(dāng)堿濃度增加到1%時，產(chǎn)糖率增加到15.550 mg。而堿濃度從l%增加到3%時，產(chǎn)糖量略有下降，且2%與3%濃度產(chǎn)糖量變化不大。從圖2可很直觀的發(fā)現(xiàn)，1%濃度的NaOH預(yù)處理的蔗渣產(chǎn)糖量最高，且為了節(jié)省實驗藥品用量，選擇的堿濃度為1%。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

Fig.1Protracting of glucose standard curve

圖2NaOH濃度對蔗渣產(chǎn)糖量的影響

Fig.2The influence of NaOH concentration on sugar yield

2.3不同NaOH預(yù)處理時間對蔗渣水解產(chǎn)糖的影響

由圖3可以看出，當(dāng)處理時間低于60 min時，酶解產(chǎn)糖量隨著預(yù)處理時間的增加而增加，當(dāng)處理時間從60 min增加到100 min時，酶解產(chǎn)糖量基本沒有變化，而且處理時間越長，能量的消耗越大。因此，綜合這兩方面原因，堿處理最適時間為60 min。

2.4不同NaOH預(yù)處理溫度對蔗渣水解產(chǎn)糖的影響

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，酶解產(chǎn)糖量逐漸升高，這說明溫度的高低是影響蔗渣的水解產(chǎn)糖效率的重要因素。另外，在圖4中還發(fā)現(xiàn)，在預(yù)處理溫度低于50 ℃時，溫度對于蔗渣水解產(chǎn)糖的影響較低，當(dāng)溫度大于50 ℃時，隨著溫度的不斷升高，蔗渣水解產(chǎn)糖量也明顯升高。因此，高溫有利于蔗渣水解產(chǎn)糖量的提高。

圖3處理時間對蔗渣產(chǎn)糖影響

Fig.3The influence of time on the sugar yield

圖4處理溫度對酶解產(chǎn)糖量的影響

Fig.4The influence of temperature on the sugar yield

2.5最佳NaOH預(yù)處理后蔗渣組分測定及分析

預(yù)處理蔗渣的目的是破壞蔗渣半纖維素和木質(zhì)素層，改變蔗渣的組成，破壞蔗渣中纖維素—半纖維素—木質(zhì)素的鏈接，從而使得纖維素酶容易吸附進入，有利于酶解反應(yīng)的進行。在探索出NaOH處理的各影響因素的最佳條件后，結(jié)合各最佳條件，對堿處理后的蔗渣進行組分分析，以考察堿處理法對蔗渣組成的影響,測定結(jié)果見表2。

表2　堿處理前后蔗渣組分

由表2可以看出，與未經(jīng)過堿處理的蔗渣相比，堿處理后的蔗渣半纖維素含量從未處理前的35.9%降低至20.4%，木質(zhì)素從19.7%降低至6.7%。結(jié)果表明，堿處理是針對半纖維素和木質(zhì)素這兩種主要成分的，纖維素含量的相對增加是由于半纖維素和木質(zhì)素含量的減少所至。通過單一堿預(yù)處理蔗渣的單因素實驗，由實驗結(jié)果得出NaOH預(yù)處理蔗渣的單因素實驗的最佳濃度為1%，最佳反應(yīng)溫度為100 ℃，最佳反應(yīng)時間60 min。在得出單一NaOH預(yù)處理的最佳預(yù)處理條件后，可用于后續(xù)加入的超聲波輔助堿的預(yù)處理環(huán)節(jié)中，同時也可用于探索單一堿預(yù)處理與超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣酶解產(chǎn)糖量與對蔗渣組成的影響。

2.6超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣提高酶解產(chǎn)糖量工藝的正交試驗結(jié)果

由表3可知，極差越大對實驗的影響就越大，通過R值，預(yù)處理因素的影響大小為：堿濃度A>預(yù)處理時間C>預(yù)處理溫度B。結(jié)果表明最佳的預(yù)處理條件為A2B3C2。但從表3中可以看出，當(dāng)預(yù)處理時間為60 min和90 min時，產(chǎn)糖量差別不大，從節(jié)省能源角度考慮，預(yù)處理時間選擇60 min為最佳，堿濃度選擇1%最佳，因而最終確定的優(yōu)化方案為：A2B1C2，即堿濃度為1%、處理溫度為80 ℃、處理時間為60 min。在最佳條件下預(yù)處理的蔗渣經(jīng)過24 h酶解后，總產(chǎn)糖量為17.847 mg，比100 ℃時單一堿處理的產(chǎn)糖量15.525 mg還要高2.322 mg，產(chǎn)糖率提高了13%，且預(yù)處理溫度降低了20 ℃。這一結(jié)果進一步說明，超聲波輔助堿是一種有效的預(yù)處理方法，它能在降低了預(yù)處理溫度的基礎(chǔ)上，提高酶解糖化過程的糖化率，有著節(jié)約能源并最大化提高預(yù)處理的效果。

表3　L9(33)正交實驗表

表4　正交實驗結(jié)果分析1

1.K為方差，其代表對于因素的試驗指標(biāo)和；k=K/3；R為極差，根據(jù)R值大小可以判斷因素主次順序。

2.7超聲波輔助堿酶解實驗不同酶解時間的影響

由圖5可以看出，在反應(yīng)的初始階段，酶解產(chǎn)糖量增加很快，而后逐漸趨于平緩，在30 h后曲線基本保持水平，說明蔗渣經(jīng)過30 h的酶解，蔗渣中的纖維素水解量已達到最大，因此酶解的最佳時間為30 h。

2.8超聲波輔助堿酶解實驗不同酶用量的影響

由圖6可以看出，在一定pH值、一定反應(yīng)時間的條件下，還原糖產(chǎn)量隨著酶濃度的增加先迅速提高而后變緩，這是因為酶濃度未達到最適濃度6.0 FPU時，還原糖產(chǎn)量隨著酶濃度的增加而增加，而超過最適濃度6.0 FPU后，酶用量對于一定量的的蔗渣已經(jīng)達到飽和，再增加酶用量酶解葡萄糖產(chǎn)量也基本不變。因此，最適酶用量為6.0 FPU。

圖5超聲波輔助堿預(yù)處理后蔗渣酶解進程曲線

Fig.5The course of enzymatic hydrolysis of ultrasonic-assisted alkali pretreated bagasse

圖6最適酶用量的確定

Fig.6The determination of optimum dose of enzyme

圖7　最適溫度確定Fig.7　The determination of optimumtempeature

2.9超聲波輔助堿酶解實驗不同酶溫度影響

由圖7可以看出，纖維素酶酶解反應(yīng)受溫度的影響較大，當(dāng)溫度低于纖維素酶解反應(yīng)的最適溫度時，產(chǎn)糖率隨著酶解反應(yīng)溫度的增加而提高，當(dāng)溫度超過50 ℃后，由于纖維素酶部分失活，使得酶解反應(yīng)產(chǎn)糖率降低，當(dāng)溫度為70 ℃時，纖維素酶已基本沒有活力。因此，可以看出酶解的最適溫度為50 ℃左右。

2.10預(yù)處理前后紅外圖譜對比結(jié)構(gòu)的改變

從圖8可以看出，堿處理和超聲波處理對蔗渣中纖維素結(jié)構(gòu)的改變有一定的作用。堿處理在3 400 cm-1左右的吸收峰最弱，這表明氫鍵的結(jié)合力是最弱的。據(jù)有關(guān)文獻表明[18]，在紅外光譜中，波長為870～1 600 cm-1是一系列的共振峰，典型的纖維素吸收峰[19]位于波長在1 000～1 200 cm-1處，纖維素的C—O—C的不對稱伸縮振動的吸收峰位于1 160 cm-1附近，纖維素和半纖維素的C—H振動吸收峰位于1 318 cm-1附近。數(shù)據(jù)顯示，預(yù)處理后的樣品特征吸收峰都有一定的變化，895 cm-1處半纖維素的特征峰也有改變。尤其是堿處理，木質(zhì)素與半纖維素結(jié)合峰(1 510 cm-1)處明顯減弱，有些甚至消失，這對于酶解產(chǎn)糖率提高影響很大。此外，木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)位于1 200-1 800 cm-1處，這一譜帶吸收峰有一定的改變，有些強吸收峰變?nèi)跎踔料?，特別是堿處理后，這一譜帶的吸收峰變?nèi)?，這說明堿處理使木質(zhì)素在預(yù)處理過程中很好地被去除了，從而減少了木質(zhì)素對纖維素酶的抗性，提高了蔗渣酶解的產(chǎn)糖率。再來比較單一堿處理與超聲波輔助堿處理的吸收光譜：在1 000～1 200 cm-1波長處的纖維素吸收峰，超聲波處理的吸收峰弱于單一堿處理的吸收峰，這說明超聲波處理后的蔗渣對其纖維素含量有所影響；在1 200～1 800 cm-1的木質(zhì)素吸收峰處，超聲波處理在此處吸收峰略弱于堿處理，這表明超聲波處理有打破細胞壁結(jié)構(gòu)使得木質(zhì)素更好的釋放的作用，從而提高酶解產(chǎn)糖率。

圖8　預(yù)處理前后蔗渣的紅外圖譜

3討論

超聲波是頻率高于20 kHz的一種彈性機械波，屬于聲波的一部分，它遵循聲波傳播的基本規(guī)律。用超聲波處理蔗渣可以打斷細胞壁的結(jié)構(gòu)，有利于破壞蔗渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的晶體結(jié)構(gòu)，使得堿液更容易滲透到蔗渣結(jié)構(gòu)中，提高糖產(chǎn)量。本文與張學(xué)金等[20]利用堿預(yù)處理蔗渣相比較，增加了超聲波的輔助處理，堿濃度降低了9%，處理溫度降低了10 ℃?？梢娡ㄟ^引進超聲波的處理，使得蔗渣結(jié)構(gòu)被破壞，提高了氫氧化鈉的利用率，降低了預(yù)處理的溫度，節(jié)約了成本。

4結(jié)論

通過NaOH預(yù)處理蔗渣的單因素實驗，得單一堿預(yù)處理蔗渣的單因素最佳實驗條件為：最佳堿濃度為1%、最佳處理時間為60 min、最佳處理溫度為100 ℃。對未處理和堿處理后的蔗渣進行組分的測定，得出與未經(jīng)過堿處理的蔗渣相比，堿處理后的蔗渣半纖維素含量從未處理前的35.9%降低至20.4%，木質(zhì)素從19.7%降低至6.7%。超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣的正交試驗表明，最佳預(yù)處理實驗條件為：堿的最佳濃度為1%、最佳處理時間為60 min、最佳處理溫度為80 ℃。對超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣酶解的單因素實驗，得出單因素最佳實驗條件為：酶解最佳時間為30 h，最佳酶用量為6.0 FPU，最佳酶解溫度為50 ℃。通過紅外光譜分析未處理、堿處理、超波輔助堿處理的蔗渣結(jié)構(gòu)，可以看出超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣，對降低蔗渣木質(zhì)素和半纖維素含量有著顯著的效果。

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(責(zé)任編輯梁健)

收稿日期：2016-03-03；

修訂日期：2016-03-25

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(2009AA06A416);廣西青年自然科學(xué)基金項目(GXNSFBA053025)；廣西桂科攻項目(14251009);清潔化制漿造紙與污染控制新技術(shù)及新理論創(chuàng)新研究團隊項目(2013GXNSFFA019005)

通訊作者：王雙飛(1963—)，男，湖南攸縣人，廣西大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師；E-mail：wangsf@gxu.edu.cn。

doi:10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.0914

中圖分類號：S566.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-7445(2016)03-0914-08

Study on ultrasound-assisted alkali pretreatment of bagasse

XIONG Jian-hua1, YU Sheng-qiang1, ZHU Hong-xiang2,3, WANG Shuang-fei2,3

(1.School of the Environment,Guangxi University, Nanning 530004, China;(2.Light Industry and Food Engineering College, Guangxi University, Nanning 530004, China；3.Guangxi Key Laboratory of Clean Pulp & Papermaking and Pollution Control，Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract：In order to improve the rate of enzymatic hydrolysis of bagasse, ultrasound technology was used for assisting alkali to pretreat bagasse. Alkali treatment on single factor experiments and orthogonal bases ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse experiments showed that the optimum parameters of ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse were: alkali concentration was 1%, the processing time was 60 min, and the treatment temperature was 80 ℃. On optimal condition that ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse experiments, the optimum parameters of enzymatic hydrolysis sugar yield on single factor experiments were: enzymolysis time was 30 h, enzyme dosage was 6.0 FPU, hydrolysis temperature was 50℃. The use of ultrasound-assisted alkali pretreatment bagasse was an effective pretreatment method that can reduce the pretreatment temperature, increase the enzymatic hydrolysis sugar yield, improve the accessibility of materials and the production efficiency, and reduce the cellulose into ethanol production cost.

Key words：ultrasonic; alkali pretreatment; optimum parameters; bagasse

引文格式：熊建華,余升強,朱紅祥，等.超聲波輔助堿預(yù)處理蔗渣的研究[J].廣西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，41(3)：914-921.