徐明忠，張如勝，蘇　良

(湖南省長沙市疾病預(yù)防控制中心　410006)

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·論著·

布魯菌PCR快速檢測方法的建立及應(yīng)用*

徐明忠，張如勝，蘇良

(湖南省長沙市疾病預(yù)防控制中心410006)

摘要:目的建立布魯菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，對其進(jìn)行應(yīng)用評價(jià)。方法針對布魯菌外膜蛋白編碼基因(omp-2)設(shè)計(jì)PCR引物，建立PCR方法，利用19種常見細(xì)菌和布魯菌株DNA分別對其進(jìn)行特異性和敏感度評價(jià)，對3株疑似布魯菌株進(jìn)行核酸檢測，并與分離培養(yǎng)法進(jìn)行結(jié)果比對。結(jié)果本研究建立的布魯菌PCR檢測方法僅能檢出布魯菌陽性菌株，對照菌DNA未出現(xiàn)目的條帶；敏感度為100拷貝/反應(yīng)；PCR方法對3株疑似布魯菌株檢出omp-2基因條帶，鑒定結(jié)果為布魯菌，與分離培養(yǎng)法結(jié)果相同。結(jié)論本研究建立了一種布魯菌PCR檢測方法，與分離培養(yǎng)法相比，布魯菌PCR方法準(zhǔn)確、快速，適合布魯菌病疫情的快速檢測。

關(guān)鍵詞:布魯菌;聚合酶鏈反應(yīng);基因

布魯菌病(簡稱布病)是一種人畜共患傳染病，人感染布魯菌后出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，同時伴有乏力、關(guān)節(jié)痛等癥狀，容易發(fā)展為慢性病。布魯菌分為6 個經(jīng)典種和19 個亞型，不同種、型之間親緣性很近[1]，其中布病主要由羊、牛、豬、犬種布魯菌感染引起。近年來,布病疫情形勢較為嚴(yán)峻,數(shù)據(jù)顯示，2004年12月至2010年7月，中國共報(bào)告布病實(shí)驗(yàn)室診斷病例141 604例[2]。2012年，長沙市寧鄉(xiāng)縣發(fā)生布病疫情，為了對該疫情病原體進(jìn)行準(zhǔn)確、快速地檢測，本文在分離培養(yǎng)法檢測的同時，建立聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法對可疑布魯菌菌株進(jìn)行了核酸檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本及菌株來源湖南省長沙市寧鄉(xiāng)縣疾病預(yù)防控制中心送檢的布病疑似患者血液標(biāo)本3例，布魯菌陽性菌株及19株常見細(xì)菌菌株由本中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑MycyclerTMthermal cycler PCR 儀(美國Bio-Rad公司)；DYCP-31E型電泳儀(北京市六一儀器廠)；通用型核酸快速提取試劑盒(華瑞安生物)；Platinum?PCR SuperMix (美國invitrogen公司)。

1.3PCR引物針對布魯菌外膜蛋白編碼基因(omp-2)設(shè)計(jì)PCR引物(omp-2- F：5′-CCA GCC ATT GCG GTC GGT A-3′；omp-2-R：5′-GCG CTC AGG CTG CCG ACG CAA-3′，預(yù)期目的片段190 bp)，引物序列由上海Life Technologies公司合成。

1.4PCR擴(kuò)增將布魯菌陽性菌株，19株常見細(xì)菌菌株及3株疑似布魯菌株提取DNA后保存于-20 ℃?zhèn)溆?，根?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e利用omp-2 引物和PCR商品化試劑盒(invitrogen Platinum?PCR SuperMix)進(jìn)行omp-2基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體積共25 μL：Platinum?PCR SuperMix 23.0 μL；20 μmol/Lomp-2-F、omp-2-R引物各0.5 μL，待檢DNA 1.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，再按94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增完成后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(100 V 30 min)，觀察有無預(yù)期目的片段(190 bp)。

1.5分離培養(yǎng)鑒定將3例疑似布病患者無菌靜脈血(5 mL)分別注入2個含雙相培養(yǎng)基的血培養(yǎng)瓶中，輕輕混合傾斜，使被檢血液均勻分布在瓊脂斜面上，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，3 d后觀察結(jié)果。如未見布魯菌生長，可按上述方法再傾斜，使血液均勻涂在瓊脂斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 d觀察1次，如有可疑布魯菌菌落，可分純至瓊脂試管培基，進(jìn)一步作布魯菌鑒定，血培養(yǎng)30 d仍不出菌，判定為陰性。

2結(jié)果

2.1PCR方法特異性分析結(jié)果1株布魯菌(第20泳道)在PCR反應(yīng)中出現(xiàn)目的條帶(190 bp)，結(jié)果為陽性，其他19種常見對照細(xì)菌均為陰性，表明PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，見圖1。

注：M為100 bp DNA Marker；1為金黃色葡萄球菌；2為腸炎沙門菌；3為鼠傷寒沙門氏菌；4為傷寒沙門氏菌；5為單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌；6為英諾克李斯特菌；7為變形桿菌屬;8為奇異變形桿菌;9為腸致病型大腸桿菌;10為產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌;11為腸出血型大腸桿菌;12為大腸桿菌;13為副溶血性弧菌;14為銅綠假單胞菌;15為腸侵襲型大腸桿菌;16為痢疾志賀菌;17為宋內(nèi)氏志賀菌;18為鮑氏志賀菌;19為福氏志賀菌;20為布魯菌。

圖1布魯菌PCR檢測方法特異性擴(kuò)增電泳圖

2.2PCR反應(yīng)敏感度結(jié)果將PCR特異性分析中擴(kuò)增出的布魯菌陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆、測序驗(yàn)證后構(gòu)建質(zhì)粒(大連寶生物生物技術(shù)公司完成)。然后利用本研究建立的布魯菌PCR方法同時檢測10倍系列稀釋的布魯菌DNA質(zhì)粒(1.0×100～1.0×105copies/μL)來評價(jià)布魯菌PCR方法敏感度。檢測結(jié)果顯示1～4泳道出現(xiàn)預(yù)期目的條帶(190 bp),PCR反應(yīng)敏感度為100 拷貝/反應(yīng)，表明本研究建立的布魯菌PCR方法敏感度高。見圖2。

注：M為100 bp DNA Marker；1～6分別為1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷貝/反應(yīng)。

圖2布魯菌 PCR方法敏感度分析

2.3分離培養(yǎng)法鑒定結(jié)果3例疑似布病患者血液標(biāo)本經(jīng)1周左右培養(yǎng)，均生長出無色透明、圓形、針尖大小的疑似布魯菌菌落(編號分別為NX201201、NX201202、NX201203)，進(jìn)一步菌落轉(zhuǎn)種和血清凝集試驗(yàn)鑒定為布魯菌。

2.4疑似布魯菌PCR擴(kuò)增結(jié)果利用布魯菌特異性基因引物(omp-2-F、omp-2-R)對NX201201、NX201202、NX201203株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均出現(xiàn)190 bp的預(yù)期omp-2基因片段，擴(kuò)增結(jié)果表明上述3株菌均為布魯菌。見圖3。

注：M為100 bp DNA Marker；1、2、3分別為NX201201、NX201202、NX201203菌株omp-2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖33株疑似布魯菌PCR電泳圖

3討論

目前，針對布病的檢測主要依賴分離培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法[3],分離培養(yǎng)方法是金標(biāo)準(zhǔn)，但分離培養(yǎng)鑒定耗時較長，且易受病期的長短、抗菌藥物治療等因素的影響而降低布魯菌分離的陽性率；免疫學(xué)方法(虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn))簡便、快速，適合布病的大面積篩檢，但也存在不能區(qū)分現(xiàn)癥和既往感染、自然感染和布病疫苗免疫后出現(xiàn)的抗體等不足之處，需要和其他方法聯(lián)合應(yīng)用來確診布病的感染。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外有較多采用PCR方法(熒光定量PCR方法、普通PCR方法)進(jìn)行布魯菌檢測的報(bào)道[4-5],Debeaumont等[6]利用熒光定量PCR方法對疑似布病患者的血液標(biāo)本進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明該方法適用于分離培養(yǎng)方法結(jié)果陰性或免疫學(xué)診斷存在抗體交叉反應(yīng)的布病患者的診斷；文獻(xiàn)[7]利用熒光定量PCR方法對1例布魯菌型脊髓炎患者進(jìn)行了診斷,相比常規(guī)培養(yǎng)方法，該方法具有較高的特異性和敏感性；但同時熒光定量PCR由于需要昂貴的熒光定量PCR儀和較高的試劑成本而限制了其廣泛的應(yīng)用[8]。文獻(xiàn)[9]利用PCR方法對布魯菌進(jìn)行了篩查和分型鑒定研究，該研究不但可以對布魯菌屬進(jìn)行檢測，還可以鑒定出牛、羊、豬種布魯菌，同時還證實(shí)PCR方法的特異性和靈敏性均高于血清凝集試驗(yàn)。

本研究參考文獻(xiàn)[10],針對omp-2設(shè)計(jì)PCR引物，配合invitrogen公司的Platinum?PCR SuperMix，建立布魯菌屬PCR檢測方法，成功將NX201201、NX201202、NX201203菌株鑒定為布魯菌，和分離培養(yǎng)方法結(jié)果相同；相比分離培養(yǎng)方法，本研究建立的布魯菌屬PCR方法具有快速，準(zhǔn)確的優(yōu)勢；相比熒光定量PCR方法，本方法具有經(jīng)濟(jì)便宜(無需昂貴的熒光定量PCR儀和合成探針)和引物保存時間較長的優(yōu)勢，適合突發(fā)布病疫情的快速檢測。同時普通PCR方法擴(kuò)增后的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行核苷酸測序和基因分析，本研究中的NX201201、NX201202、NX201203菌株即通過PCR產(chǎn)物直接測序證實(shí)為羊種布魯菌。本研究建立的PCR方法僅能確定是否為布魯菌，尚不能進(jìn)行分型鑒定是其不足之處，下一步將嘗試分型鑒定和對血液標(biāo)本提取核酸后直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來減少布病職業(yè)暴露的風(fēng)險(xiǎn)。

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*基金項(xiàng)目：湖南省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科研課題項(xiàng)目(B2015-153)。

作者簡介：徐明忠，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.005

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1760-03

(收稿日期：2016-02-23修回日期：2016-05-04)

Establishment and application of a rapid PCR detection method of Brucella spp.*

XUMingzhong,ZHANGRusheng,SULiang

(ChangshaMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha,Hunan410006,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a polymerase chain reaction(PCR) method for detecting Brucella spp. and to evaluate its application.MethodsThe PCR primer aiming at the outer membrane protein(omp-2) coding gene were designed and the PCR method for detecting Brucella spp. was established.By using DNA of 19 kinds of common bacteria and Brucella spp.,the specificity and sensitivity were evaluated.Three strains of suspected Brucella spp. were performed the nucleic acid detection.Then,3 suspected strains of Brucella spp. were amplified by the PCR method with omp-2 gene，and the results were compare to the those by the culture method.ResultsThe established Brucella spp. PCR detection method could only detect the Brucella spp. positive strain,the control bacterium DNA did not appear the target band;the sensitivity was 100 copies/response;the PCR method detected omp-2 gene band in 3 strains of suspected Brucella spp.,which was identified as Brucella spp. and was same to the results by the isolation culture method.ConclusionThe established PCR method for detecting Brucella spp. is accurate and rapid compare with the isolation and culture method,which is suitable for the rapid detection of brucellosis epidemic situation.

Key words:Brucella spp.;polymerase chain reaction;gene