竇曉娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，藺瑞函，馬愛(ài)國(guó)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島　266000)

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大劑量維生素D3補(bǔ)充對(duì)糖尿病大鼠胰島及肌肉細(xì)胞組織學(xué)的影響

竇曉娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，藺瑞函，馬愛(ài)國(guó)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266000)

摘要：目的：探討大劑量維生素D3補(bǔ)充對(duì)糖尿病(DM)大鼠Lee’s指數(shù)及胰島、肌肉細(xì)胞組織學(xué)的影響。方法：高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合注射鏈脲佐菌素的方法制備DM模型，不同濃度的維生素D3灌胃6w，HE染色觀察胰島和肌肉形態(tài)。結(jié)果：125倍和200倍維生素D3組大鼠Lee’s指數(shù)比DM組明顯升高。各維生素D干預(yù)組胰島和骨骼肌組織學(xué)形態(tài)明顯改善。結(jié)論：適量維生素D3補(bǔ)充能增加DM大鼠Lee’s指數(shù)，恢復(fù)異常的胰島和肌肉形態(tài)。

關(guān)鍵詞：糖尿??；維生素D3；Lee’s指數(shù)；肌肉；胰島細(xì)胞

糖尿病(DM)是一種由于胰島素分泌和(或)作用缺陷引起的慢性代謝紊亂性疾病，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，其患病率都有逐年升高的趨勢(shì)，已成為日益增長(zhǎng)的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。研究表明，DM患者除了心臟、腎臟、視網(wǎng)膜等器官組織的損傷外，還可導(dǎo)致各種類(lèi)型的胰腺和肌肉損傷。DM存在著進(jìn)行性胰島β細(xì)胞功能惡化和胰島萎縮，有報(bào)道稱(chēng)，DM患者胰島β細(xì)胞功能比正常人降低50%，胰島細(xì)胞數(shù)量降低60%[2，3]，說(shuō)明胰島功能缺陷在DM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。DM患者消耗大量脂肪和蛋白質(zhì)，肌肉組織不能正常利用葡萄糖和有效釋放能量，體重和Lee’s指數(shù)明顯降低，同時(shí)機(jī)體組織失水和電解質(zhì)失調(diào)，可能還存在著肌肉組織自身的病變，因此對(duì)DM患者進(jìn)行胰島β細(xì)胞功能的干預(yù)，恢復(fù)體重和肌肉功能可能延緩DM的發(fā)生發(fā)展，并減少其并發(fā)癥[4，5]。

維生素D是一種重要的調(diào)節(jié)鈣磷平衡和脂質(zhì)代謝的激素，維生素D3是其最常見(jiàn)的一種形式[6]。近年來(lái)有研究證明，維生素D除了這些常見(jiàn)的功能以外，還具有一些其他的重要功能，如調(diào)控胰島素抵抗和增加體重等。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人群中維生素D受體基因的多態(tài)性與DM的發(fā)生存在一定相關(guān)性，且DM患者血清中活性維生素D3水平顯著低于正常人群[7]。目前，關(guān)于大劑量維生素D3補(bǔ)充對(duì)DM患者體重及肌肉和胰島組織學(xué)形態(tài)影響的研究鮮有報(bào)道。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，體重180～220g之間(山東省魯抗制藥公司提供，合格證為soxk 魯20130001)；膽固醇、膽鹽(河南平頂山生物制品公司)；STZ(美國(guó)sigma公司)；血糖儀和試紙(Contour TS，日本拜耳保健有限責(zé)任公司)；維生素D3(青島雙鯨公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2糖尿病大鼠模型制備及維生素D干預(yù)

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(12只)和糖尿病造模組(88只)。大鼠飼養(yǎng)在籠中，每籠5～6只，保持度在25℃左右，每天光照12h，自由采食和飲水，每周準(zhǔn)確稱(chēng)量大鼠體重。對(duì)照組大鼠喂養(yǎng)不含維生素D的基礎(chǔ)飼料、造模組大鼠喂養(yǎng)不含維生素D的高糖高脂飼料(含68.5%的基礎(chǔ)飼料、20%的蔗糖、10%的豬油、1%的膽固醇及0.5%的膽鹽)。喂養(yǎng)4w后，造模組空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg體重、對(duì)照組空腹注射檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg 體重，注射后24h和72h測(cè)大鼠空腹血糖，2次空腹血糖均>11.1 mmol/L且大鼠出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿和體重減輕癥狀為造模成功[8]。在本研究中，88只大鼠中造模成功80只，造模成功率為91%。造模成功后，所有的大鼠均保持與之前相同的飲食。將造模成功的80只大鼠隨機(jī)分為5組，每組16只。6組大鼠給予不同劑量的維生素D連續(xù)灌胃6w，對(duì)照組N和糖尿病模型組DM組，給予生理劑量的維生素D(36 IU /kg體重)，5N、25N、125N和200N組分別給予5、25、125、200倍生理劑量的維生素D，劑量分別為180、900、4 500和7 200IU/kg體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠的數(shù)量為N組12只、DM組14只、5N組13只、25N組14只、125N組15只、200組15只。

1.3檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1體重、Lee’s指數(shù)及血清25(OH)D大鼠飼養(yǎng)期間，每周準(zhǔn)確稱(chēng)量大鼠體重。處死大鼠后，用皮尺量取大鼠的體長(zhǎng)，計(jì)算Lee’s指數(shù)，計(jì)算方法為：[體重(g)×103/體長(zhǎng)(cm)]1/3。連續(xù)灌胃第6w末，清晨空腹經(jīng)水合氯醛麻醉后處死。經(jīng)腹主動(dòng)脈取大鼠全血5mL，離心后取上層血清，血清25(OH)D采用放射免疫法檢測(cè)。

1.3.2大鼠胰島及肌肉組織病理切片分離大鼠的胰腺和肌肉置于固定液中，采用HE染色的方法制備大鼠胰腺和肌肉組織切片，顯微鏡下觀察胰腺和肌肉組織學(xué)的形態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)兩兩比較用LSD方法進(jìn)行，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1DM大鼠造模情況

在本研究中，造模的大鼠共有88只，造模成功的有80只，造模成功率為91%。

2.2維生素D3干預(yù)后各組大鼠血清25(OH)D 濃度

維生素D3干預(yù)6w后，25N、125N和200N組大鼠血清25(OH)D濃度明顯高于N組和DM組(P<0.05)，并呈現(xiàn)明顯劑量—效應(yīng)關(guān)系(表1)。

表1　各組大鼠25(OH)D 濃度

注：a與N組相比，P<0.05；b與DM組相比，P<0.05。

2.3維生素D3干預(yù)對(duì)大鼠體重和Lee’s指數(shù)的影響

從第5w注射STZ后DM組大鼠體重較N組明顯降低(P<0.05)。用維生素D3灌胃后，與DM組相比，125N組體重有明顯的增長(zhǎng)(P<0.05)，接近于正常水平，說(shuō)明每日補(bǔ)充125倍生理劑量的維生素D3可顯著增加DM大鼠的體重。大鼠Lee’s指數(shù)見(jiàn)表2，DM組大鼠比N組明顯降低(P<0.05)，用維生素D3灌胃后，125N和200N組大鼠Lee’s指數(shù)明顯升高，與DM組相比，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，125N組接近于正常水平。

表2　各組大鼠Lee′s指數(shù)

注：a與N組相比，P<0.05；b與DM組相比，P<0.05。

2.4各組大鼠胰島及肌肉組織學(xué)形態(tài)

圖1中N組大鼠的胰腺組織染色(×200)顯示，正常組胰島細(xì)胞成團(tuán)索狀分布，形態(tài)正常，胞漿豐富，染色淡，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，呈圓形，位于中央。DM組大鼠胰島細(xì)胞明顯減少，體積減小，失去正常形態(tài)，核溶解或固縮，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良或腫脹。5N、25N、125N和200N組大鼠胰島細(xì)胞體積比DM組增大，胰島細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞形態(tài)比DM組明顯好轉(zhuǎn)，其中，5N、25N、125N組更明顯。

圖2顯示，N組大鼠肌肉組織HE染色(×200)肌纖維飽滿(mǎn)，平行排列呈束狀，可見(jiàn)明暗相間的條紋，肌漿均勻，細(xì)胞核排列整齊。DM組大鼠肌纖維束明顯變窄薄弱，間隔變大，肌漿不均勻，細(xì)胞核排列紊亂，肌細(xì)胞萎縮變小，細(xì)胞間隙變大，顯示肌肉萎縮。經(jīng)維生素D3干預(yù)后，與DM組相比，5N、25N、125N和200N組大鼠肌纖維束變厚，間隙變窄，肌細(xì)胞明顯增大，說(shuō)明VD3干預(yù)能緩解DM大鼠肌肉萎縮的狀況。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，適量的維生素D3補(bǔ)充能夠增加DM大鼠體重，并對(duì)DM大鼠異常的肌肉和胰島組織學(xué)形態(tài)起到改善作用。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已有一些有關(guān)維生素D補(bǔ)充對(duì)DM影響的報(bào)道，但其對(duì)DM影響的劑量-效應(yīng)關(guān)系的研究很少，因此很難確定維生素D對(duì)DM的最佳作用劑量。Hyoung-Jun 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)12w攝入維生素D 1 200 IU/d，對(duì)2型DM老年女性的去脂體重沒(méi)有顯著影響，而Robin M 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，每日攝入維生素D增加到2 000IU時(shí)，可以改善老年2型DM患者對(duì)血糖的控制，改善身體成分并增強(qiáng)心血管健康，這說(shuō)明低劑量的維生素D補(bǔ)充對(duì)DM患者或維生素D缺乏的患者作用不大，維生素D只有在高劑量時(shí)才能對(duì)DM患者發(fā)揮作用。因而在本研究中，生理劑量的維生素D(36IU/kg 體重)用于N組和DM組，5倍生理劑量的維生素D用于5N組，此劑量也是維生素D的可耐受最高攝入量(UL，成年人為 2 000IU/d、大鼠為180IU/d/kg體重)，其他劑量分別為25倍(900IU/kg體重)、125倍(4 500IU/kg體重)和200倍(7 200 IU/kg體重)[11]。

維生素D進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟中轉(zhuǎn)化為25(OH)D，在腎臟進(jìn)一步羥化成為維生素D的活化形式1，25(OH)2D3。由于25(OH)D在血中含量相對(duì)較高，半衰期長(zhǎng)，較1，25(OH)2D3更穩(wěn)定，因此目前臨床上普遍通過(guò)測(cè)定血中25(OH)D的水平來(lái)反映機(jī)體維生素D儲(chǔ)備情況。Lee’s指數(shù)是目前在評(píng)價(jià)成年大鼠肥胖程度方面的有效指數(shù)。有研究表明，維生素D可以調(diào)節(jié)能量代謝[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)6w每天攝入125倍和維生素D可以增加DM大鼠的體重和Lee’s指數(shù)，并使其接近正常大鼠水平，連續(xù)6w每天攝入200倍維生素D也可以增加大鼠的Lee’s指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可以通過(guò)作用于呼吸鏈能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，影響細(xì)胞能量代謝，糾正高糖負(fù)荷造成的細(xì)胞能量代謝紊亂，繼而使細(xì)胞發(fā)揮正常功能[13]。

圖1　各組大鼠胰島組織學(xué)形態(tài)

圖2　各組大鼠的肌肉組織學(xué)形態(tài)

本研究發(fā)現(xiàn)，在病理學(xué)上，DM模型組大鼠肌肉和胰腺組織損傷加重，明顯大于正常對(duì)照N組。大劑量的維生素D3干預(yù)下大鼠肌肉和胰腺組織，其損傷都明顯小于DM模型組，說(shuō)明維生素D3對(duì)DM大鼠的肌肉和胰腺具有保護(hù)作用。DM患者常會(huì)有“糖尿病肌病”，即表現(xiàn)為四肢軟弱無(wú)力，肌肉酸痛等癥狀，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)肌肉萎縮，可能是由于周?chē)窠?jīng)病變、代謝障礙和微血管病變等所致的一系列復(fù)雜的病理過(guò)程。Curry等[14]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D嚴(yán)重缺乏的兔肌肉中肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)ATP-依賴(lài)的Ca2+攝取孤立小泡比VD充足的兔明顯減少，在預(yù)先補(bǔ)充維生素D后，該結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。1，25(OH)2D3可以通過(guò)Ca-ATPase向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+，在維生素D缺乏的動(dòng)物中，肌細(xì)胞內(nèi)重要的收縮蛋白肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白C的水平降低，給予維生素D治療后上述蛋白的表達(dá)量恢復(fù)正常，由此可見(jiàn)，維生素D可以改善異常的肌肉形態(tài)。胰島素(INS)主要由胰島β細(xì)胞分泌，能提高肝臟和肌肉組織攝入葡萄糖(GLU)，促進(jìn)GLU進(jìn)入肌肉組織細(xì)胞內(nèi)。在INS缺乏的時(shí)候，進(jìn)入組織的GLU減少，肝糖原的分解和異生增強(qiáng)，由肝臟釋放入血的GLU增加，血糖水平升高，超過(guò)腎糖閾會(huì)從尿中排除，表現(xiàn)為DM[15]。大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)，DM發(fā)病是一個(gè)長(zhǎng)期的胰島β細(xì)胞慢性損傷與凋亡過(guò)程[16]。臨床流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)胞層次的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DM患者口服維生素D3有助于保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能，減少急性高糖刺激引起的β細(xì)胞的損傷，改善DM并發(fā)癥[17]。郭麗萍[18]等研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度影響胰島細(xì)胞中的INS表達(dá)分泌情況。INS的分泌依賴(lài)于β細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度及β細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)通路的活化，而活性維生素D3對(duì)于鈣信號(hào)通路的激活意義重大。

在本研究中，我們應(yīng)用了從生理劑量到200倍生理劑量較大范圍內(nèi)的不同水平維生素D補(bǔ)充，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道，同時(shí)，在造模時(shí)我們得到了一個(gè)高達(dá)91%的成模率，但是此研究是針對(duì)大鼠的，其研究結(jié)果不能直接推及到人。本研究為大劑量維生素D3干預(yù)對(duì)能量代謝及肌肉和胰腺組織的影響提供了重要的科學(xué)依據(jù)，其機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究?！?/p>

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(責(zé)任編輯李婷婷)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81472983)。

作者簡(jiǎn)介：竇曉娟(1989—)，女，碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)流行病學(xué)。

通訊作者：汪求真(1971—)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營(yíng)養(yǎng)流行病學(xué)。

Influence of High Dosage of Vitamin D3Supplementation on Islet and Muscle Histology Morphology in Diabetic Rats

DOU Xiao-juan，WANG Qiu-zhen，HAO Hai-bo，GUO Yu-mei，LIN Rui-han，MA Ai-guo

(College of Public Health，Qingdao University，Qingdao 266000，China)

Abstract：ObjectiveTo discuss the influence of high dosage of vitamin D3supplementation on Lee’s index， islet，and muscle histology form in diabetic rats.MethodWe established diabetic rats models by intraperitoneally injection streptozocin based on high-fat diet.The rats were divided into 6 groups and supplemented with four different high doses of vitamin D3 for 6 weeks，islet muscles morphology were observed by HE staining.ResultTotally 125 times vitamin D3 supplementation could increase the Lee’s index of diabetic rats when compared with DM group.Islet and muscles morphology were obviously improved in vitamin D3 supplementation group.ConclusionModerate vitamin D3 supplementation could increase the weight of diabetic rats and recover abnormal morphology of islet and muscles.

Keywords：diabetes mellitus(DM)；vitamin D3；Lee’s index；muscle；islet