韓金龍+李慧++藺經(jīng)++楊青松++常有宏

摘要：為探討外源鈣對鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化系統(tǒng)的影響，以梨砧木杜梨幼苗為供試材料，在水培條件下，研究外源施加不同濃度的鈣對200 mmol/L NaCl脅迫下其葉片抗氧化酶活性、活性氧產(chǎn)生、膜質(zhì)過氧化和抗氧化物質(zhì)含量的影響。結(jié)果顯示：NaCl脅迫3 d后，杜梨葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性減弱，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性增強(qiáng)，活性氧（O-2 · 、H2O2）和丙二醛（MDA）大量積累，抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（AsA）合成下降。施加外源CaCl2能增強(qiáng)NaCl脅迫下杜梨葉片中SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px、APX的活性，減少O-2 · 和H2O2的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化程度，提高GSH和AsA的含量，有效緩解鹽脅迫對杜梨葉片的過氧化傷害，其中以10 μmol/L CaCl2處理效果最為顯著。說明NaCl處理可對杜梨葉片造成氧化傷害，施加低濃度（5～10 μmol/L）CaCl2處理可緩解鹽脅迫對杜梨葉片抗氧化系統(tǒng)的影響。

關(guān)鍵詞：杜梨；鈣；鹽脅迫；活性氧；抗氧化酶

中圖分類號： S661.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0245-03

收稿日期：2015-04-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31372051）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）5018]。

作者簡介：韓金龍（1989—），男，山西霍州人，碩士研究生，主要從事果樹逆境生理和分子生物學(xué)研究。E-mail：hjlong24@126.com。

通信作者：常有宏，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹育種和栽培生理研究。E-mail：cyh@jaas.ac.cn。土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與生態(tài)環(huán)境的一個重要因素。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上約有10億hm2鹽漬地，我國約占其中的3.75%，并且每年隨著次生鹽漬地的擴(kuò)張，對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[1]。植物在鹽脅迫下最直接的影響就是抑制其生長，嚴(yán)重時會造成滲透脅迫和離子脅迫，破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，甚至導(dǎo)致其死亡[2]。因此，如何更好地利用開發(fā)鹽漬地資源，已成為人們探討的熱點(diǎn)。而近些年，人們通過對外源緩沖劑研究的深入，已將其視為提高植物緩解鹽脅迫的重要手段。

鈣（calcium，Ca）是植物生長發(fā)育所必需的一種大量元素，在植物體內(nèi)起著極其特殊的作用。它不僅能夠維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，參與調(diào)節(jié)無機(jī)離子運(yùn)輸，而且作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，能夠?qū)庑畔鬟f給胞內(nèi)，從而引起一系列的生理生化變化。目前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到逆境脅迫時，植物體細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度會上升，并通過Ca2+與CaM結(jié)合，形成Ca2+-CaM復(fù)合體，再對逆境脅迫信號的感受、傳遞和響應(yīng)，啟動一系列生理生化過程，以適應(yīng)外界環(huán)境[3]。同時，外源施加鈣也能提高植物的抗寒性[4]、抗熱性[5]和抗鹽性[6]等多種抗性。本試驗對鹽脅迫下施加不同濃度鈣離子，分析其對杜梨葉片抗氧化系統(tǒng)的影響，旨在為緩解梨樹鹽脅迫提供理論依據(jù)。

梨是世界及我國主栽果樹之一。隨著土壤鹽漬化程度的不斷加劇，嚴(yán)重限制了梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。梨樹主要靠嫁接來繁殖，選擇抗性強(qiáng)的砧木對嫁接苗的生長至關(guān)重要。杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）原產(chǎn)于中國，將其作為嫁接苗的砧木，能夠提高梨樹的耐鹽能力[7-8]。杜梨在鹽脅迫下，通過減少Na+在根中積累和向地上部運(yùn)輸來適應(yīng)逆境[9-10]，但在高鹽脅迫下，植物仍能受到氧化脅迫等傷害[11]。本試驗對鹽脅迫下施加不同濃度鈣離子，分析其對杜梨葉片抗氧化系統(tǒng)的影響，旨在為緩解梨樹鹽脅迫提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1植物材料培養(yǎng)和處理

將杜梨種子埋在濕沙中至于4 ℃溫度中，經(jīng)3個月的低溫處理后，將有胚根幼苗移植于水培系統(tǒng)中（培養(yǎng)液為Hoagland 營養(yǎng)液，pH值5.8），并放置于光照培養(yǎng)箱中，每3 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件如下：光照周期16 h/8 h（光照/黑暗），光照強(qiáng)度300 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度（25 ± 0.5） ℃，空氣相對濕度60%～70%。待植株長至8葉1心時，選擇長勢一致的健壯幼苗，并用蒸餾水沖洗干凈，用含 200 mmol/L NaCl的Hoagland 營養(yǎng)液進(jìn)行處理，并添加一定濃度的CaCl2母液，使其在水培系統(tǒng)中的濃度達(dá)到 0、5、10、50、100 μmol/L。以生長在不含NaCl和CaCl2的Hoagland 營養(yǎng)液中的植株作為對照。每個處理設(shè)3次重復(fù)，處理3 d后收集杜梨葉片，用于測定各種生理指標(biāo)。

1.2測定指標(biāo)及方法

1.2.1活性氧和丙二醛含量測定過氧化氫（H2O2）含量測定參照Patterson等的方法[12]。新鮮葉片用2 mL 預(yù)冷丙酮提取后，經(jīng)5%硫酸鈦處理所生成的氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，用2 mmol/L H2SO4溶解后，在415 nm波長下比色測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算葉片中H2O2含量。采用羥胺氧化法來測定超氧陰離子（O-2 · ）的產(chǎn)生速率[13]，單位為nmol/（g·min）。采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量[14]，單位為nmol/（g·min）。

1.2.2抗氧化酶活性測定蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[15]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑（nitroblue tretrazolium chloride，NBT）光氧化還原法，以抑制 NBT 光氧化還原50%的酶量為1個酶活性單位[16]；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]，以1 min內(nèi)D470 nm值變化0.01為1個酶活性單位；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的測定參照Aebi的方法[17]，以1 min內(nèi)D240 nm值變化0.1為1個酶活性單位；利用紫外分光光度法測定谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）的活性，以 340 nm處的吸光度變化為NADPH的消耗量，計算GR活性[18]；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性采用黃愛纓等的方法[19]測定，以每毫克蛋白質(zhì)1 min使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個活性單位（扣除非酶促反應(yīng)）。參照Nakano等的方法[20]來測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbic acid peroxidase，APX）的活性，以1 min內(nèi)D290 nm值變化0.1為1個酶活性單位。

1.2.3抗氧化物質(zhì)含量總谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量采用5，5-二巰基-2-硝基苯酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）法[21] 測定；抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）含量采用分光光度法測定，在紅菲咯啉存在的條件下，AsA所還原的亞鐵離子與其反應(yīng)形成紅色螯合物，通過測定D534 nm來計算AsA含量[22]。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007、SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制作表格，并運(yùn)用LSD法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1鈣對鹽脅迫下杜梨葉片活性氧和MDA含量的影響

由表1可以看出，在鹽脅迫（200 μmol/L NaCl）處理3 d后，杜梨葉片中超氧陰離子（O-2 · ）的產(chǎn)生速率是對照的2.37倍，H2O2、MDA的含量分別是對照的2.24、1.64倍，這會造成植株葉片細(xì)胞活性氧代謝系統(tǒng)失去平衡，發(fā)生膜脂過氧化。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，O-2 · 的產(chǎn)生速率、H2O2和MDA的含量均隨著CaCl2濃度的增加呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。當(dāng)CaCl2為5 ～ 10 μmol/L時，O-2 · 的產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA的含量顯著降低（降低27.6%～42.8%、36.1%～42.9%、10.6%～25.0%），且10 μmol/L CaCl2處理組中，上述3個指標(biāo)最低（表1）。然而，當(dāng)CaCl2為50～100 μmol/L 時，反而會刺激活性氧的積累（O-2 · 產(chǎn)生速率和H2O2含量增加），加劇膜質(zhì)過氧化（MDA積累）。

2.2鈣對鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化酶活性的影響

由表2可知，鹽脅迫（200 μmol/L NaCl）處理3 d后，杜梨葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低（僅為對照的60.4%），而過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性均有不同程度升高（為對照的1.18～1.78倍）。這表明NaCl脅迫可輕微誘導(dǎo)杜梨葉片中POD、CAT、GR、GSH-Px、APX活性增強(qiáng)，卻抑制SOD的活性。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，抗氧化酶的活性均隨著CaCl2濃度的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢。當(dāng)CaCl2為 10 μmol/L 時，抗氧化酶（除APX）的活性較鹽脅迫下差異最明顯（為鹽脅迫下的1.21～1.46倍）。然而，當(dāng)CaCl2為50～100 μmol/L 時，抗氧化酶（除APX、GSH-Px）的活性較10 μmol/L CaCl2處理又顯著降低，且100 μmol/L CaCl2處理與鹽脅迫下相比較，抗氧化酶活性差異不顯著。而當(dāng)CaCl2為5 ～ 100 μmol/L時，APX的活性均沒有顯著差異，但均比對照顯著增強(qiáng)。

2.3鈣對鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響

由表3可知，鹽脅迫（200 μmol/L NaCl）處理3 d后，杜梨葉片中抗氧化物質(zhì)GSH、AsA含量顯著降低（僅為對照的382% ～ 44.9%），嚴(yán)重影響植株自身清除自由基的能力。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，抗氧化物質(zhì)含量隨著CaCl2濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)CaCl2為5～100 μmol/L 時，GSH的含量較鹽脅迫下均顯著提高，其中以CaCl2為10 μmol/L時差異最顯著，含量為鹽脅迫下的2.43倍。AsA的含量隨著CaCl2濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中當(dāng)CaCl2為10～100 μmol/L 時，AsA的含量較鹽脅迫下均顯著提高，且在10 μmol/L時差異最顯著，含量為鹽脅迫下的2.07倍。

3結(jié)論與討論

鹽脅迫會引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化的變化，影響植物的正常生理調(diào)節(jié)。鈣是植物生長發(fā)育的必需元素，當(dāng)植物處于鹽脅迫時，細(xì)胞內(nèi)的鹽離子與Ca2+的吸收形成競爭作用，使得Ca2+不能被充分利用，導(dǎo)致植物細(xì)胞對Ca2+的緊缺。鹽脅迫對植物體的傷害，主要是通過對質(zhì)膜完整性和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的破壞[23-24]，而添加一定濃度的外源鈣能夠有效緩解鹽脅迫對其帶來的傷害[25]。這可能是因為添加外源鈣不僅能夠補(bǔ)充植物體本身所需的鈣元素，而且能夠增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性，恢復(fù)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，同時維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。而鈣是一種膜保護(hù)劑，能夠穩(wěn)定膜上的蛋白質(zhì)，降低質(zhì)膜透性，維持細(xì)胞內(nèi)的離子區(qū)域化，使得植物細(xì)胞內(nèi)的各種生理代謝正常進(jìn)行，從而提高植物的耐鹽性。

高濃度的鈣對植物體的影響則截然相反。有研究表明，高濃度的Ca2+能夠降低植物的葉綠素含量和光合強(qiáng)度，同時對水稻幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用[26]。這可能是因為過多的鈣離子積累會打破細(xì)胞內(nèi)原有的營養(yǎng)平衡，對植物細(xì)胞造成新的離子毒害，迫使細(xì)胞產(chǎn)生滲透脅迫等不利于植物生長的因素。同時，高濃度的Ca2+還會引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度變化，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列生理生化的變化，造成膜損傷等傷害[27]。另外，雖然Ca2+與Na+的生物功能不同，但是它們的化學(xué)性質(zhì)卻有很多相似性，在吸收過程中會形成競爭關(guān)系，而且離子過量對植物的傷害都是一樣的。本試驗中添加的CaCl2在為杜梨幼苗提供了所需要的Ca2+的同時，也過量積累了NaCl脅迫中的Cl-·，加劇了植物的鹽脅迫。

本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫下，杜梨葉片中O-2 · 產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA含量均顯著增加；同時SOD活性降低，卻在不同程度上刺激了POD、CAT、GR、GSH-Px、APX的活性，使它們的活性增強(qiáng)；但抗氧化物質(zhì)GSH、AsA的含量顯著降低。而在添加5、10、50、100 μmol/L CaCl2后，它們的含量或者活性都呈一定的變化規(guī)律，且在CaCl2濃度為 10 μmol/L 時，活性氧的含量降至最低水平，有效緩解了膜脂過氧化，同時所有抗氧化酶的活性達(dá)到最高水平，抗氧化物質(zhì)的含量與對照條件下差異不顯著，因此，鹽脅迫對杜梨葉片帶來的氧化損傷也是最低的?？赡苁且驗楫?dāng)CaCl2濃度為 5 μmol/L 或10 μmol/L 時，植物對鈣離子吸收增多，吸收到的鈣離子能與細(xì)胞膜上的相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低膜透性，避免吸收更多的Na+；同時Ca2+通過對細(xì)胞內(nèi)離子區(qū)域化作用，將胞內(nèi)多余的Na+區(qū)隔開，從而保證細(xì)胞內(nèi)各種代謝正常進(jìn)行，對提高植物的耐鹽性有一定的作用。當(dāng)CaCl2濃度為50 μmol/L或100 μmol/L時，植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增多，可能對植物細(xì)胞造成了新的離子傷害，使得活性氧含量上升，膜脂過氧化加劇，抗氧化酶的活性減弱，同時抗氧化物質(zhì)含量也顯著降低。這表明單純的鈣處理對植物緩解鹽脅迫的能力是有限的，其具體原因還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，200 mmol/L鹽脅迫能對杜梨葉片造成很大程度的氧化傷害，而施加低濃度（5～10 μmol/L）CaCl2可以有效緩解這些傷害，這可能與Ca2+在植物中能夠維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性，具有離子區(qū)域化作用，作為細(xì)胞內(nèi)第二信使調(diào)節(jié)植物生理代謝等作用有關(guān)。

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