韓曉霞++章靜鋼++張鵬博++宗宇++陳文榮++郭衛(wèi)東

摘要：鐵皮石斛屬于傳統(tǒng)名貴中藥，由于人們的過(guò)度采挖，其野生資源日益減少，遺傳多樣性遭到嚴(yán)重破壞，人工栽培是對(duì)石斛資源進(jìn)行保護(hù)的有效措施之一。本研究采用15對(duì)SSR引物對(duì)5個(gè)實(shí)生群體的100株鐵皮石斛進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期檢測(cè)群體之間和群體內(nèi)部的遺傳分化，確定純化株系，為后期優(yōu)良品種選育提供理論參考。結(jié)果表明，15個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到185個(gè)等位基因，群體B6的等位基因數(shù)目最大，為7.14個(gè)；群體B11等位基因數(shù)最少，為 5.42個(gè)；觀察雜合度（Ho）最大的種群為B6（0.376），群體B10最?。?.286）。近交系數(shù)（Fis）最大值出現(xiàn)在群體B10中，為0.241；群體B6近交指數(shù)最小，僅為0.091。STRUCTURE遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)石斛實(shí)生群體可能來(lái)自2個(gè)同源基因庫(kù)。實(shí)生群體B10遺傳背景單一，可以用于后續(xù)的鐵皮石斛純化育種，群體B6具有較高的雜合度，可以用作種間雜交的良好材料，有利于種間差異性狀的整合。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；SSR；實(shí)生群體；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S567.23+9.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0090-04

收稿日期：2015-05-02

基金項(xiàng)目：浙江省金華市科學(xué)技術(shù)局農(nóng)業(yè)類重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2012-2-018）。

作者簡(jiǎn)介：韓曉霞（1993—），女，山西朔州人，碩士研究生，主要從事特色經(jīng)濟(jì)植物研究。E-mail：15268636679@163.com。

通信作者：宗宇，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锓N質(zhì)資源與遺傳。E-mail：yzong@zjnu.cn。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬植物，屬于傳統(tǒng)名貴中藥，由于人們的過(guò)度采挖，鐵皮石斛野生資源日益減少，已近枯竭，遺傳多樣性遭到嚴(yán)重破壞。1987年鐵皮石斛因數(shù)量銳減，被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》[1-2]。鐵皮石斛的人工栽培是對(duì)石斛資源進(jìn)行保護(hù)的有效措施之一，雖然近幾年人工栽培鐵皮石斛取得了較大的進(jìn)展，但由于種質(zhì)混雜、盲目引種等原因，致使鐵皮石斛質(zhì)量和產(chǎn)量差異較大，擾亂了消費(fèi)市場(chǎng)，阻礙鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的正常、有序發(fā)展[3-8]。因此，開(kāi)展鐵皮石斛種質(zhì)資源和遺傳多樣性研究，對(duì)鐵皮石斛優(yōu)良品種的選育具有重要意義。

遺傳多樣性是生物多樣性的基本組成元素，豐富的遺傳多樣性可以維持種群動(dòng)態(tài)平衡，為物種的進(jìn)化提供基本保障；評(píng)價(jià)一個(gè)物種的遺傳多樣性也是制定該物種科學(xué)保護(hù)策略的重要前提。前人在鐵皮石斛遺傳多樣性研究方面取得了一定進(jìn)展，沈潔等利用RAMP標(biāo)記對(duì)9個(gè)野生居群的112株鐵皮石斛進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，不同居群間存在豐富的遺傳多樣性，而且居群之間存在一定地域相關(guān)性[9]。丁鴿等采用RAPD技術(shù)對(duì)8個(gè)鐵皮石斛野生居群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)引物S412可以有效鑒別8個(gè)野生居群；同樣發(fā)現(xiàn)居群的地理分布與居群間的遺傳關(guān)系呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性[10]。Li等利用AFLP標(biāo)記對(duì)12個(gè)鐵皮石斛居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)居群間分化系數(shù)變幅為0.047～0.578，居群間的遺傳變異平均值為26.97%[11]，研究結(jié)果支持將這12個(gè)鐵皮石斛居群分為3大類群。Ding等利用SRAP標(biāo)記對(duì)鐵皮石斛的9個(gè)野生種的84個(gè)植株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在物種水平上遺傳多樣性較高，而在居群水平上差異性較低[12]。Shen等利用ISSR標(biāo)記技術(shù)將 8個(gè)野生鐵皮石斛居群區(qū)分開(kāi)來(lái)，發(fā)現(xiàn)了16個(gè)具有特異性標(biāo)記的DNA片段[13]。謝明璐等利用開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記成功對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)進(jìn)行了純度鑒定[14]。但是基于SSR的鐵皮石斛遺傳多樣性研究仍鮮有報(bào)道，更缺乏對(duì)人工栽培鐵皮石斛實(shí)生群體的遺傳多樣性分析，相關(guān)研究缺失不利于鐵皮石斛優(yōu)良品種的選育，會(huì)造成雜交親本的盲目選擇。

核基因SSR標(biāo)記在真核生物基因組中分布非常普遍，由于其豐富的多態(tài)性和共顯性遺傳等特征，被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)和種群間遺傳變異的分析。本研究利用15對(duì)SSR引物對(duì)鐵皮石斛不同實(shí)生群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，主要目的在于：（1）評(píng)估石斛實(shí)生群體的近交系數(shù)，確定純化株系；（2）檢測(cè)石斛實(shí)生群體之間和群體內(nèi)部的遺傳分化；（3）為后期人工雜交育種提供理論參考。

1材料與方法

在鐵皮石斛實(shí)生苗群體中選取表觀性狀優(yōu)良的5個(gè)群體，分別標(biāo)記為B4、B6、B10、B11、B12，每個(gè)群體隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)較為一致的鐵皮石斛20株，單株編號(hào)分別為1～20，共100株用于遺傳多樣性分析。分別從100個(gè)單株上取健康幼嫩的葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

1.1DNA提取

利用優(yōu)化后的CTAB法[15]進(jìn)行DNA提取。從葉片中提取基因組總DNA（圖1），每份樣品使用1 g葉片。DNA提取后使用TE緩沖液溶解，置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序

使用15對(duì)前人報(bào)道的、在石斛中擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性好的SSR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)（表1）。引物由Invitrogen（上海）公司合成，并合成5′端經(jīng)過(guò)熒光修飾（FAM和HEX 2種熒光）的M13-Tail通用引物（序列為：TGTAAAACGACGGCCAGT）[19]。PCR體系為20 μL，各組分體積見(jiàn)表2。

PCR反應(yīng)步驟及條件：94 ℃預(yù)變性5 min；隨后是94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后反應(yīng)條件設(shè)置為94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，12個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸6 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖2），確認(rèn)得到單一且長(zhǎng)度正確的片段后，將PCR產(chǎn)物送至生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行基因分型（圖3）。

1.3數(shù)據(jù)處理

為盡可能避免基因分型過(guò)程中的偏差，確定等位基因大小后進(jìn)行了2次人工校對(duì)。對(duì)于每個(gè)種群和SSR位點(diǎn)，使用GenAlEx 6.501[20]計(jì)算等位基因個(gè)數(shù)（Na）、有效等位基因個(gè)數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數(shù)（Fis）。利用FSTAT 2.9.3[21]計(jì)算經(jīng)過(guò)香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）。

利用STRUCTURE 2.3.4軟件[22]計(jì)算同源基因庫(kù)的數(shù)

目，該方法利用貝葉斯概率統(tǒng)計(jì)將鐵皮石斛個(gè)體或預(yù)定義的群體劃分到K個(gè)支系中來(lái)解釋其遺傳結(jié)構(gòu)。本研究中，STRUCTURE 2.3.4的運(yùn)行選擇混合模型和關(guān)聯(lián)等位基因頻率等參數(shù)配置，將同源基因庫(kù)個(gè)數(shù)的賦值為1～8（N+3），每個(gè)K值進(jìn)行10次重復(fù)計(jì)算來(lái)推測(cè)最佳的K值。每一次運(yùn)行使用200 000個(gè)循環(huán)的馬爾科夫鏈-蒙特卡洛模擬（MCMC），初始收斂周期為100 000；其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。運(yùn)行后結(jié)果上傳到STRUCTURE HARVESTER（http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）確定最佳K值，運(yùn)行結(jié)束后利用CLUMPP軟件處理對(duì)10次獨(dú)立運(yùn)行得到的分配系數(shù)進(jìn)行均一化處理，然后使用DISTRUCT軟件繪制計(jì)算結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1SSR引物多樣性

15對(duì)SSR引物共檢測(cè)到185個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目從2.3個(gè)（DNeSSR86）到22.6個(gè)（DOeSSR41）不等，平均每個(gè)位點(diǎn)有12.3個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)從1.3個(gè)（DNeSSR86）到9.2個(gè)（DOeSSR41），平均值為5.5個(gè)。香農(nóng)多樣性指數(shù)最大值是2.61（DOeSSR41），最小值是0.31（DNeSSR86），平均值為1.82。觀察雜合度最大值是0.756（DOeSSR44），最小值是0114（DNeSSR86），平均值為0.604。期望雜合度最大值為0.786（DNeSSR37），最小值為0.169（DNeSSR86），平均值為0.654。表明本研究中使用的SSR引物大部分多態(tài)性良好，可用于后續(xù)的群體遺傳信息分析；其中引物DOeSSR33、DNeSSR86、DOeSSR117多態(tài)性顯著低于其他引物（表3）。

2.2鐵皮石斛群體的遺傳多樣性

對(duì)5個(gè)石斛實(shí)生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)群體B6的等位基因數(shù)目最多，為7.14個(gè)，其次是群體B12，為6.50個(gè)；群體B4和B10等位基因數(shù)均為5.64個(gè)；群體B11等位基因數(shù)最少，為5.42個(gè)；5個(gè)實(shí)生群體的有效等位基因數(shù)存在一定的差異，以群體B6的有效等位基因數(shù)目最大，為6.57

個(gè)，最小值雖然出現(xiàn)在群體B11中，但是與群體B4幾乎沒(méi)有差異（表4）。觀察雜合度最大的種群是B6，為0.376，群體B12略低于B6，為 0.361；群體B4、B11沒(méi)有顯著差別，觀察雜合度分別為 0.309、0.329；群體B10最小，僅為0.286。期望雜合度表現(xiàn)出的趨勢(shì)與觀察雜合度相似，最大值和最小值分別出現(xiàn)在群體B6和群體B11，群體B6為0.654，群體B11為0.514。分別對(duì)5個(gè)石斛種群的近交系數(shù)進(jìn)行了計(jì)算。近交系數(shù)最大值出現(xiàn)在群體B10中，為0.241；其次為群體B4，為0.168；群體B6近交指數(shù)最小，僅為0.091。

2.3鐵皮石斛群體的遺傳結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)群體的遺傳多樣性信息，基于貝葉斯統(tǒng)計(jì)法對(duì)5個(gè)鐵皮石斛實(shí)生群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。STRUCTURE結(jié)果顯示，對(duì)5個(gè)群體的K值范圍設(shè)為1～8，運(yùn)行10次重復(fù)后，將STRUCTURE的運(yùn)行結(jié)果上傳到STRUCTURE HARVESTER并通過(guò)前人描述的方法確定最佳的K值，在K=2處觀察到ΔK的最大值（圖4），結(jié)果表明，5個(gè)石斛實(shí)生群體可能來(lái)自2個(gè)同源基因庫(kù)（圖5）。

從STRUCTURE結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，除群體B6中的一些個(gè)體表現(xiàn)出較為明顯的多源遺傳背景外，其他4個(gè)群體種質(zhì)純度較高，以群體B10遺傳背景最為單一，與之前的雜合度、近交系數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)保持一致。

3結(jié)論與討論

本研究采用15對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)5個(gè)石斛實(shí)生群體共100個(gè)個(gè)體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，15個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到185個(gè)等位基因，群體B6的等位基因數(shù)目最多，群體B11等位基因數(shù)最少，5個(gè)石斛實(shí)生群體可能來(lái)自2個(gè)同源基因庫(kù)。雜合度水平可以在很大程度上反映植物的遺傳多樣性[23-24]。雜合度較低與石斛的繁育系統(tǒng)有關(guān)，鐵皮石斛自交和雜交均可育，試驗(yàn)使用的實(shí)生種群來(lái)自于自交群體，但人工授粉失敗或隔離措施不完善可能造成一些個(gè)體是開(kāi)放式授粉形成的實(shí)生苗，這可能是導(dǎo)致B6群體雜合度高于其他群體的原因。

近交系數(shù)的取值為[-1，1]，負(fù)值表示群體種雜合個(gè)體較多，群體的形成可能受到了外源基因流的影響，并非自交育種過(guò)程中成功構(gòu)建的群體。正值表明群體間的近交繁殖有所增加，對(duì)于自然群體來(lái)講可能是因?yàn)槿后w大小的減小或人為的干預(yù)[20]。本研究石斛實(shí)生群體為近親或自交形成的種系，有較高的近交系數(shù)是正?，F(xiàn)象，而且群體B10近交系數(shù)最大，表明其遺傳背景較為單一，種質(zhì)比其他實(shí)生群體更加純化，這一點(diǎn)也能通過(guò)B10具有最小的觀察雜合度得到佐證。

基于種質(zhì)雜合背景，因遺傳背景單一，實(shí)生群體B10可以用于后續(xù)的純化選擇，但是否屬于石斛特征性狀（石斛多糖、石斛堿含量等）還需進(jìn)一步研究。與其他實(shí)生群體相比，群體B6具有較高的雜合度，可以用作石斛種間雜交的良好材料，有利于種間差異性狀的整合。

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