盧 紅，賴金龍，劉 聰，付 倩，吳 國，陶宗婭

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101)

一株鍶高效富集真菌的篩選、鑒定及富集特性

盧 紅，賴金龍，劉 聰，付 倩，吳 國，陶宗婭*

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101)

為利用微生物技術(shù)修復(fù)環(huán)境中的鍶(Sr)污染，通過從鍶污染的土壤中分離、篩選Sr的高效富集菌種，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化該菌對Sr的富集條件．結(jié)果顯示，通過富集培養(yǎng)、稀釋平板涂布篩選出一株對Sr具有較強(qiáng)富集能力的真菌，經(jīng)鑒定該菌為Talaromyces sp．．利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化后，各因素的最佳水平組合為:培養(yǎng)溫度35℃，pH值3．0，Sr初始質(zhì)量濃度50 mg/L，該菌(干重)對Sr的富集量達(dá)到1 815．21 mg/kg，優(yōu)化后的富集量與理論預(yù)測值較接近，說明響應(yīng)曲面法建立的模型可用于預(yù)測該菌對Sr2+的富集特性．結(jié)果表明，篩選得到的Talaromyces sp．對Sr的富集能力強(qiáng)，可用于環(huán)境中的Sr污染修復(fù)．

鍶;真菌;富集;響應(yīng)曲面法

隨著核工業(yè)、核技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，它們在給人類帶來巨大社會經(jīng)濟(jì)效益的同時，也產(chǎn)生了大量放射性廢物排入環(huán)境中形成放射性污染［1］．這些放射性廢物包括90Sr、54Mn、55Fe、60Co、63Ni、129I、134Cs、234U等［2］．其中90Sr作為主要的放射性核廢物，其化學(xué)性質(zhì)與Ca2+相似，具有半衰期長(28．9 a)、危害性大等特點(diǎn)［3］，使90Sr極易通過食物鏈進(jìn)入動物或人體內(nèi)，替換骨骼中的Ca2+，形成內(nèi)輻射，導(dǎo)致血細(xì)胞、骨細(xì)胞和皮膚細(xì)胞大量死亡，對健康帶來危害．因此，放射性Sr2+的環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)已受到廣泛關(guān)注［4－6］．

近年來，利用生物修復(fù)技術(shù)清除土壤中放射性核素的應(yīng)用研究已取得一些成果，如利用植物修復(fù)技術(shù)，在90Sr的污染區(qū)種植超富集植物(如向日葵、粗根大戟、毛蕊花和黃耆)，通過此類植物的吸收和富集以達(dá)到清除土壤中的90Sr，修復(fù)效果較好［7－9］．然而，利用植物修復(fù)技術(shù)治理水中的90Sr污染存在一定局限，目前研究顯示，采用微生物修復(fù)技術(shù)吸收溶液中的90Sr，如固定化的耐輻射奇球菌［10］、啤酒酵母［11］等微生物對Sr的吸收率最高可達(dá)98%，表明該技術(shù)的修復(fù)效果理想．同時，該技術(shù)具有投入低，操作簡便，無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍已越來越廣［12－13］．但現(xiàn)階段，篩選出的耐受性強(qiáng)、吸收效果好的微生物菌種仍較為缺乏，在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用．因此，本研究擬從88Sr污染的盆栽土壤中分離篩選Sr2+的高效富集菌，并通過單因素富集優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)曲面法提供菌株對Sr2+的富集能力，旨在為環(huán)境修復(fù)治理中微生物資源的高效利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的菌株資源．

1 材料與方法

1．1 主要儀器設(shè)備 原子吸收分光光度計(jì)(TAS－990，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);PCR儀(S1000，美國伯樂公司);瓊脂糖水平電泳槽(DYCP 31DN型，北京澤蘭西科技有限公司);穩(wěn)壓電泳儀(DYY－6C型，南京科弋創(chuàng)生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國伯樂公司);酸度計(jì)(PHS－4C+，深圳市三利化學(xué)品有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX－50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG－9245A，上海金璃儀器設(shè)備有限公司);天平(精度0．001g);恒溫?fù)u床(DHZ－CA，上海市百典儀器廠);1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL移液器及槍頭;超凈工作臺;水浴恒溫震蕩儀等．

1．2 培養(yǎng)基及主要成分 液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基: CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，SrCl 20．01 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，質(zhì)量濃度為 870 mg/L的Sr2+，蒸餾水1 L．馬丁培養(yǎng)基(篩選培養(yǎng)基):蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，10 g/L孟加拉紅溶液3．3 mL，10 g/L鏈霉素0．3 mL，不同質(zhì)量濃度的Sr2+，蒸餾水1 L．

富集培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基):CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，不同質(zhì)量濃度的Sr2+，蒸餾水1 L．所有化學(xué)試劑均為分析純．

1．3 抗性真菌的分離純化 選用的土壤是本研究室模擬Sr2+污染的盆栽土壤，該盆栽土壤已栽種一季印度芥菜，土壤質(zhì)地為:壤土，其理化性質(zhì)如表1所示．其中，Sr2+的污染水平為870 mg/kg，是我國土壤背景值的5倍(目前我國土壤中Sr2+的背景值平均水平為167 mg/kg)［14］，屬于Sr2+的重度污染土壤．

表1 土壤樣本的理化性質(zhì)Table 1 The physical and chemical properties of tested pot－soil samples

樣品采樣及預(yù)處理:去除表層土3 cm，避免地面微生物與土樣混合，再采用多點(diǎn)混合采樣法．將土樣裝入保鮮袋中，自然風(fēng)干后，過2 mm篩除去植物殘?jiān)^篩土樣裝入保鮮袋于4℃保存．

稱取2．000 g土樣，接種至100 mL液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)6 d，將處理后的土壤懸液靜置10 min后，吸取1．0 mL上清液，轉(zhuǎn)接至新鮮的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集培養(yǎng)6 d．

分離純化:富集培養(yǎng)后，吸取0．1 mL菌懸液，梯度稀釋至10－1～10－6，分別涂布到馬丁固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)6 d后，挑選單菌落，反復(fù)劃線純化并鏡檢，純化的菌株保藏于斜面培養(yǎng)基中．

1．4 高效富集菌的篩選 將分離純化后得到的抗性菌株分別接種到ρ(Sr2+)為350 mg/L富集培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)6 d后，4 500 r/ min離心10 min，棄上清液，沉淀中加入20 mmol/L EDTA－Na210 mL離心10 min，棄上清液，沉淀中再加入10 mL蒸餾水離心10 min，棄上清液，取沉淀烘干至恒重，加入消解液(硝酸∶高氯酸的體積比為3∶1)，消解澄清后，定容，原子吸收分光光度計(jì)(TAS－990，北京普析)測定Sr2+含量，分析比較各菌株對Sr2+的富集能力，篩選出高效富集菌株．

1．5 高效富集菌的抗性及分子鑒定 將篩選出的高效富集菌接種至ρ(Sr2+)為1 000 mg/L馬丁培養(yǎng)基中，28℃倒置培養(yǎng)6 d后，觀察菌株生長情況．

真菌ITS鑒定:采用植物總DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取菌株總DNA后，擴(kuò)增真菌ITS序列．送樣測序(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成)．將基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLAST將菌株的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的基因序列進(jìn)行對比，采用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1．6 抗性菌株對Sr2+富集效果的單因素條件優(yōu)化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平全組合實(shí)驗(yàn)，見表2．將1 mL菌懸液接種至滅菌后的ρ(Sr2+)100 mg/L富集培養(yǎng)基中，在相應(yīng)的培養(yǎng)溫度、初始濃度和pH值條件下，150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)6 d后，參照1．4，測定菌株對Sr2+的富集量．

表2 實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 The experimental factors and levels

1．7 響應(yīng)曲面法優(yōu)化菌株對Sr2+的富集效果依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選富集效果最佳的單因素范圍，利用Design－Expert 8．0．6 Trial軟件對富集條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示．將1 mL菌懸液接種至滅菌后的各富集培養(yǎng)基中，依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需設(shè)置的培養(yǎng)條件，于150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)6 d后，參照1．4，測定菌株對Sr2+的富集量．

1．8 數(shù)據(jù)分析與處理 采用SPSS 18．0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan法多重比較，Origin 9．0作圖．

2 結(jié)果與分析

2．1 高效富集菌的篩選及鑒定 經(jīng)過富集培養(yǎng)后，從土壤中共分離純化得到10株對Sr2+具有抗性的真菌，對其進(jìn)行二次篩選，即篩選出高效富集菌株．結(jié)果顯示，當(dāng)富集培養(yǎng)基中ρ(Sr2+)為350 mg/L時，富集培養(yǎng)6 d后，菌株B3富集Sr2+的能力最強(qiáng)，達(dá)到28．78 mg/g，顯著高于其他菌株的Sr2+富集量(P＜0．05)(圖1)．抗性實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)ρ(Sr2+)為1 000 mg/L時(圖2，II)，菌株B3單菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)與ρ(Sr2+)0 mg/L無明顯的差異(圖2，I)．將菌株B3的ITS序列在NCBI上進(jìn)行blast檢索比較，通過MEGA6．0軟件，采用N－J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示．結(jié)果表明，B3與Talaromyces的基因序列具有100%的同源性，因此，鑒定B3為Talaromyces sp．．

2．2 B3對Sr2+富集效果的優(yōu)化 培養(yǎng)溫度:當(dāng)富集培養(yǎng)基中ρ(Sr2+)為100 mg/L時，隨著培養(yǎng)溫度升高(20～40℃)，B3對Sr2+的富集量呈先升后降的趨勢;當(dāng)溫度為35℃，富集量顯著高于其他溫度培養(yǎng)組(P＜0．05)，達(dá)到725．43 mg/kg(圖4(A))．因此，B3富集Sr2+的最佳培養(yǎng)溫度為35℃．

pH:當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃，Sr2+初始質(zhì)量濃度為100 mg/L時，隨著培養(yǎng)基pH值增加(pH 3～8)，B3對Sr2+的富集量呈現(xiàn)先升后降的趨勢;當(dāng)pH值為4時，B3對Sr2+的富集量顯著高于其他處理組(P＜0．05)，富集量達(dá)到1 556．76 mg/kg(圖4(B))．因此，B3富集Sr2+的最佳pH值為4．

Sr2+初始質(zhì)量濃度:當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃，隨著富集培養(yǎng)基中Sr2+初始質(zhì)量濃度提高到50 mg/L，B3對Sr2+的富集量呈先升后降的趨勢;當(dāng)ρ(Sr2+)為40 mg/L時，B3對Sr2+的富集量顯著高于其他Sr2+初始質(zhì)量濃度組(P＜0．05)，達(dá)到1 535．22 mg/kg(圖4(C))．因此，B3富集Sr2+的最佳初始質(zhì)量濃度為40 mg/L．

2．3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化富集效果 根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，即最佳培養(yǎng)溫度(A)35℃、最佳Sr2+初始質(zhì)量濃度(B)mg/L、最佳pH值(C)4時，采用響應(yīng)曲面法，對B3的富集效果進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳富集條件，結(jié)果如表3所示．利用Design Expert 8．0．6 Trial軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇Quadratic模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元回歸模型:

經(jīng)檢驗(yàn)，回歸模型顯著(P＜0．01)，模型確定系數(shù)為R2=0．909 3，表明此模型能解釋90．93%的響應(yīng)值變化，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好．模型失擬性分析顯示，失擬性不顯著(P＞0．05)，表明所擬合的回歸方程在整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合度較好，符合實(shí)驗(yàn)要求，可用該回歸模型對Sr2+富集量進(jìn)行估算(表4)．各參數(shù)(A、B、C)顯著性檢驗(yàn)顯示，該模型一次項(xiàng)參數(shù)B影響極顯著(P＜0．01)，參數(shù)C影響顯著(P＜0．05)，參數(shù)A影響不顯著(P＞0．05);交互項(xiàng)AB，AC，BC和二次項(xiàng) A2、B2、C2均不顯著(P＞0．05)(表5)．依據(jù)回歸模型，利用Origin 9．0軟件建立矩陣，繪制3D響應(yīng)曲面圖．結(jié)果顯示，當(dāng)pH值固定為4時，隨著Sr2+初始質(zhì)量濃度增加，B3對Sr2+的富集量先升后降;隨著培養(yǎng)溫度增加，富集量逐漸上升;當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃、初始質(zhì)量濃度為48．06 mg/L時，富集量最大，達(dá)到1 006．47 mg/kg (圖5)．當(dāng)濃度固定為40 mg/L時，隨著培養(yǎng)溫度升高和pH值降低，B3對Sr2+的富集量逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃、pH值為3．0時，富集量最大，達(dá)到1 531．09 mg/kg(圖6)．當(dāng)培養(yǎng)溫度固定為35℃時，隨著Sr2+初始質(zhì)量濃度增加，富集量呈現(xiàn)先升后降的趨勢;隨著pH值提高，富集量逐漸降低．當(dāng)Sr2+初始質(zhì)量濃度為49．032 mg/L，pH值為3．0時，Sr2+富集量最大，達(dá)到1 230．59 mg/kg(圖7)．

經(jīng)Design Expert 8．0．6 Trial軟件分析，得到B3富集Sr2+的最優(yōu)條件為:培養(yǎng)溫度35℃，Sr2+初始質(zhì)量濃度49．69 mg/L，pH值3．0時，B3對Sr2+富集量的理論值為1 715．17 mg/kg．

模型驗(yàn)證:考慮到實(shí)際操作的可行性，將模擬得到的最佳富集條件調(diào)整為:溫度35℃，Sr2+初始質(zhì)量濃度50 mg/L，pH值3．0．在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測3次平行試驗(yàn)的平均富集量為1 815．21 mg/kg，與模型理論預(yù)測值1 715．17 mg/kg相差不大，表明該模型預(yù)測性好，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化富集條件具有一定的可靠性．

3 討論

近年來，利用細(xì)菌類、真菌類以及藻類作為生物吸附劑處理放射性核素已取得一定研究成果，如篩選出的耐輻射奇球菌對 輻照耐受性強(qiáng)，對鈾(U)、鍶(Sr)具有較強(qiáng)的富集能力［15－16］;以廢棄啤酒酵母作為生物吸附劑，啤酒酵母菌對Sr的理論飽和吸附量可達(dá)到29．67 mg/g［17］．采用固定化技術(shù)，通過海藻酸鈉(SA)及聚乙烯醇(PVA)－SA固定化載體包埋、固定耐輻射奇球菌，對Sr吸附率最高達(dá)到98%左右［10］．本文通過將高濃度 Sr(10 mmol/kg)添加到土壤中，通過模擬Sr污染環(huán)境，經(jīng)過長期馴化后，從土壤中分離得到一株鍶高效富集真菌Talaromyces sp．，該菌株與已有報(bào)道的耐受性菌株(如:啤酒酵母、耐輻射奇球菌、面包酵母、枯草芽孢桿)具有類似特性［18］，具有富集量大，耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)．通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其富集能力最高可達(dá)到115．21 mg/kg，活菌的富集能力較強(qiáng)．

表3 BOX－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 BOX－Behnken design and the experimental results

表4 二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)results of the second－order regression model

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 5 Regression coefficient and their significance for the quadratic polynomial model

已有研究表明，活菌對核素(如:鈾)的吸收方式主要包括細(xì)胞壁結(jié)合和胞內(nèi)富集兩條途徑［18］，如微生物的細(xì)胞壁主要由多聚糖構(gòu)成，可有效阻滯、結(jié)合重金屬［19］;假單胞菌屬、硫桿菌屬微生物可通過自身代謝過程將鈾富集于細(xì)胞內(nèi)［18］．本文篩選出的Talaromyces sp．，屬于黃絲曲霉屬真菌，其細(xì)胞壁主要含有幾丁質(zhì)、甘露聚糖及糖蛋白等［20］，這些多聚糖可與細(xì)胞膜結(jié)合，結(jié)合后的蛋白中含有許多活性基團(tuán)，如:羧基、磷酸基、氨基和羥基［21－22］，能與 Sr共價(jià)結(jié)合、絡(luò)合后，固定在細(xì)胞壁．同時，依賴于細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，通過自身代謝過程也可將部分Sr富集到細(xì)胞內(nèi)．

綜上，本研究篩選出一株對Sr富集能力很強(qiáng)的真菌，經(jīng)鑒定，菌種為Talaromyces sp．．根據(jù)單因素條件優(yōu)化、響應(yīng)曲面法建立模型以及模型驗(yàn)證，得到該菌對Sr2+的最佳富集條件為:培養(yǎng)溫度35℃，pH值3．0，Sr2+初始質(zhì)量濃度50 mg/L，其對Sr2+的富集量可達(dá)到1 815．21 mg/kg．優(yōu)化后的實(shí)際富集量與理論預(yù)測值較接近，表明響應(yīng)曲面法建立的模型可用于預(yù)測該菌對Sr2+富集特性．然而，較多研究者認(rèn)為微生物死細(xì)胞的吸附行為與細(xì)胞本身的新陳代謝沒有關(guān)系，對核素具有更好的吸附力［23］．因此，后續(xù)將以該菌為生物吸附劑，驗(yàn)證死細(xì)胞對Sr2+的吸附能力．

致謝 四川師范大學(xué)校級青年項(xiàng)目(14QN07);四川師范大學(xué)重點(diǎn)培育項(xiàng)目(ZP1609);四川省生物質(zhì)改性材料工程技術(shù)研究中心開放課題(12ZXBK03)對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意．

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A Research on the Screening，Identification，and Enrichment Characteristics of a Fungi Strain with Efficient Enrichment to Strontium

LU Hong，LAI Jinlong，LIU Cong，F(xiàn)U Qian，WU Guo，TAO Zongya

(College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

In order to use microorganism removing environment of strontium，this paper obtained an efficient enrichment of fungi strain by screening of microorganisms from Sr2+polluted soil．Meanwhile，Sr enrichment conditions of the fungi strain was optimized by using response surface method．The results showed a fungi strain has obtained，which has efficient enrichment ability for Sr，identifying as Talaromyces sp．．After the optimizing by response surface method，the best combination of various factors was:a culture temperature of 35℃，a pH value of 3 and a initial concentration of 50 mg/L，the enrichment value was up to 1815．21 mg/kg，which was closed to the prediction．It showed that the model established from response surface method can be used to predict the fungus enrichment characteristics of Sr2+．In general，Talaromyces sp．had stronger capacity of enriching Sr，it should have a great application potential to remove environment of strontium．

strontium;fungi;enrichment;response surface method

Q939．96

A

1001－8395(2016)04－0581－07

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．023

(編輯 陶志寧)

2015－07－17

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)課題(14ZA0030)

*通信作者簡介:陶宗婭(1957—)，女，教授，主要從事植物逆境生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究，E－mail:t89807596@163．com