梁　立， 胡建平,2， 杜文義， 左　柯， 劉　嵬， 茍小軍

(1.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都　610106;2.樂山師范學(xué)院 化學(xué)學(xué)院, 四川 樂山　614004)

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Pim-1蛋白激酶與3,5-二取代吡唑并吡啶衍生物的分子識別研究

梁立1， 胡建平1,2， 杜文義1， 左柯1， 劉嵬1， 茍小軍1

(1.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都610106;2.樂山師范學(xué)院 化學(xué)學(xué)院, 四川 樂山614004)

摘要：具有絲/蘇氨酸激酶活性的Pim-1蛋白激酶(Pim-1 protein kinase,PPK)的過度表達(dá)能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是一個有效的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn).對PPK與3,5-二取代吡唑并吡啶衍生物(3,5-Disubstituted pyrazolopyridine derivatives,DPD)的復(fù)合物進(jìn)行了20 ns的分子動力學(xué)模擬，從能量角度分析了二者結(jié)合的主要驅(qū)動力以及I 185在識別過程中的重要作用，并對復(fù)合物體系在模擬過程中的構(gòu)象變化進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，PPK的核心區(qū)的保守性是其發(fā)揮生理功能的重要機(jī)制，模擬結(jié)果對基于PPK抑制劑的藥物設(shè)計具有一定參考作用.關(guān)鍵詞： Pim-1蛋白激酶；分子動力學(xué)模擬；成簇分析；自由能曲面圖；構(gòu)象變化

0引言

癌癥亦稱惡性腫瘤，是一類由控制細(xì)胞生長增殖機(jī)制失常而引起的疾病，是目前威脅人類健康的主要疾病之一[1].研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶通過磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)活性，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，其活性異常或過度表達(dá)會引發(fā)癌癥、糖尿病、炎癥神經(jīng)退行性疾病等[2-3].因此，在使用小分子化合物對腫瘤治療的研究方面，蛋白激酶已成為一個重要的靶點(diǎn)[4].Pim基因最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒而被人們發(fā)現(xiàn)[5].Pim家族包括Pim-1、Pim-2和Pim-3，它們均具有絲/蘇氨酸激酶活性的原癌基因，都包含一個被稱為ATP錨的活化位點(diǎn)，屬于鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶，在多細(xì)胞的進(jìn)化過程中高度保守[6-7].結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明[5]，PPK的催化結(jié)構(gòu)域覆蓋了從Y 38～M 290的氨基酸區(qū)域，這個區(qū)域中G 45～G 50段loop區(qū)是一個保守的甘氨酸環(huán)狀模序，L 44～V 52以及K 67是磷酸鹽結(jié)合位點(diǎn)，而D 167是一個質(zhì)子受體位點(diǎn).Bachmann等[8]發(fā)現(xiàn)，K67若突變?yōu)榧琢虬彼?，則可導(dǎo)致PPK的失活性突變.PPK的作用機(jī)制是通過磷酸化不同的底物而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生.

目前，分子動力學(xué)(Molecular dynamics,MD)可以在計算機(jī)上計算出分子的軌跡數(shù)據(jù)、結(jié)合模式以及能量和氫鍵等，用以推測和評價藥物小分子與受體大分子相互作用的結(jié)合模式[9].Nishiguchi等[10]用X-ray方法解析出了PPK-DPD復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并證明DPD對PPK具有較好的抑制效果，但是他們之間的識別驅(qū)動力以及復(fù)合物體系在水溶液中的含水構(gòu)象變化等問題尚不得知.對此，本研究采用MD模擬方法對上述問題展開研究，進(jìn)而為研究DPD與PPK的識別機(jī)理提供幫助.圖1為本研究的DPD衍生物的分子結(jié)構(gòu).

圖1二取代吡唑并吡啶衍生物的分子結(jié)構(gòu)

1計算方法

1.1MD模擬

基于PPK-DPD的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB代碼：3T9I)[10]，刪除結(jié)晶水部分，僅保留A鏈和小分子DPD，以此作為MD模擬的初始構(gòu)象.由于A鏈中的SEP261是一個含有磷酸根的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(SEP)，這將導(dǎo)致程序無法識別，但是通過觀察PPK蛋白的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SEP 261～S 306的結(jié)構(gòu)處于整個蛋白的外側(cè)，并且遠(yuǎn)離蛋白中DPD結(jié)合的位置，對二者的識別基本無影響，可以將SEP 261～S 306的氨基酸刪除，因此，用于MD模擬的蛋白質(zhì)殘基范圍是P 33～S 260，共228個氨基酸.

MD模擬采用Amber程序[11]，力場為Amber力場，蛋白質(zhì)的力場參數(shù)均基于實(shí)驗(yàn)值擬合[12].模擬溫度為300 K，溶劑采用TIP3P水模型[13].首先，在溶質(zhì)抑制劑外圍加上1.0 nm的去頭八面體水盒子，總共加入7 921個水分子，含水后體系的總原子數(shù)為27 476個.在MD模擬之前，對體系進(jìn)行了2次能量優(yōu)化：首先，約束溶質(zhì)(約束力常數(shù)為2.09×105 kJ/mol·nm2)，用最陡下降法優(yōu)化200步，再用共軛梯度法優(yōu)化1 800步；其次，在去除所有約束后進(jìn)行200步最陡下降法優(yōu)化和1 800步共軛梯度法優(yōu)化，收斂條件為能量梯度小于4.18×10-4kJ/mol·nm.MD.模擬分為2步：先進(jìn)行2 ns約束溶質(zhì)的MD模擬(約束力常數(shù)為4.18×103 kJ/mol·nm2)，期間溫度從0 K逐步升高到300 K；接著再進(jìn)行18 ns的無約束恒溫MD模擬.在模擬過程中，用VMD圖像顯示軟件實(shí)時跟蹤體系的構(gòu)象，采用SHAKE算法[14]約束鍵長，MD模擬的積分步長設(shè)為2 fs，非鍵相互作用截斷半徑設(shè)為1 nm，每隔1 ps采集一次構(gòu)象，共采集20 000個構(gòu)象.

1.2能量分解

能量分解采用MM/GBSA(Molecular mechanics/generalized born surface area)方法[15]，其基本思路是把每個殘基的能量貢獻(xiàn)近似分為用分子力學(xué)方法計算的真空分子內(nèi)能，極性溶劑化能用廣義波恩(GB)模型[16]計算，非極性溶劑化能用LCPO模型[17]計算，并且將能量分解到殘基的主鏈原子和側(cè)鏈原子上.據(jù)此，可以進(jìn)一步考察蛋白質(zhì)中的主要?dú)埢鶎Y(jié)合物分子所產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)與結(jié)合物分子結(jié)合的主要位點(diǎn).

1.3成簇分析

對體系MD模擬所獲得的20 000個構(gòu)象進(jìn)行成簇分析，分析采用MMTSB工具[18]，計算過程使用Daura等[19]的策略，其基本思路是：依次逐個計算20 000個構(gòu)象的RMSD值，設(shè)定一個RMSD域值，將20 000個構(gòu)象中RMSD處于該域值的構(gòu)象歸為一簇，并將每簇中的能量最低構(gòu)象作為該簇的代表性構(gòu)象.本研究對復(fù)合物的20 000個構(gòu)象進(jìn)行了RMSD域值為0.23 nm的成簇分析.

1.4自由能曲面

自由能曲面(Free energy landscape，F(xiàn)EL)表示在生物學(xué)過程中發(fā)生的動力學(xué)變化，它可以通過模擬過程中的體系最穩(wěn)定狀態(tài)(即自由能曲面圖的最小值)和體系變化過程中的瞬時狀態(tài)(即分界點(diǎn))來分析[20].主成分分析(Principle component analysis,PCA)可以表示體系中最重要的動力學(xué)過程，并可用于繪制自由能曲面圖[21]，其定義為，

ΔG(x)=-kBTlnP(X)

式中，X為本征向量(PC)，kB為Boltzmann常數(shù)，T為絕對溫度，P(X)則為體系對PC的貢獻(xiàn)值.在本研究中，PC1和PC2的計算是FEL分析的基礎(chǔ)，并可以聯(lián)合成簇分析來討論體系的構(gòu)象變化.

2結(jié)果與討論

2.1分子整體的模擬分析

2.1.1體系勢能.

PPK與DPD復(fù)合物體系勢能隨時間的變化曲線如圖2所示.

圖2體系勢能隨時間變化

從圖2可知，體系勢能在2 ns后趨于平衡，在2 ns之前能量的平均值為-3.35×105kJ/mol，漲落幅度為1%，較大的漲落幅度與在模擬初始階段溶劑化效應(yīng)使得體系需要快速消除內(nèi)部晶體堆積作用有關(guān).體系能量在2 ns之后保持穩(wěn)定，平均值為-3.43×105kJ/mol，波動范圍為0.1%，對于具有27 476個原子的大體系來說，漲落誤差可以忽略不計.由此可見，體系的整個模擬過程是平穩(wěn)可靠的.

2.1.2方均根偏差.

PPK與DPD復(fù)合物的Cα原子方均根偏差(Root mean square deviation，RMSD)隨時間的變化曲線如圖3所示.

圖3體系方均根偏差隨時間的變化

從圖3可知，在2 ns之前體系的Cα原子RMSD值穩(wěn)定在較低的值，這是由于在MD模擬時首先對體系進(jìn)行了2 ns的約束MD模擬，因此體系的運(yùn)動幅度很小.在2～11 ns范圍內(nèi)，體系的RMSD值為0.260±0.061 nm，波動幅度為23%，體系的RMSD值迅速上升，這是由于體系從約束到無約束的過程中，體系原子會出現(xiàn)較大的振動幅度，在11 ns之后體系Cα原子的RMSD為0.293±0.014 nm，波動幅度約為4%，處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài).另外，從圖3中可以看出，體系的RMSD在11 ns前后出現(xiàn)了較大的波動，預(yù)示體系在11 ns前后可能有較為明顯的構(gòu)象變化過程.

2.1.3方均根漲落.

復(fù)合物體系整體Cα原子的方均根漲落(Root mean square fluctuation,RMSF)分布如圖4所示.

圖4體系Cα原子的方均根漲落分布

從圖4可知，漲落較大的區(qū)域?yàn)?，S 59～N 61、P 81～G 83、Y 215、E 243～E 246和R 256～S 260，用VMD觀察其在水溶液中的運(yùn)動情況可以發(fā)現(xiàn)，S 59～N 61和P 81～G 83 2個區(qū)域分別處于2個β折疊之間的loop區(qū)，并且處于整個體系的外側(cè)，充分暴露在水環(huán)境中；Y 215位于2個α螺旋之間，與周圍的殘基作用較弱；E 243～E 246是一段偏離質(zhì)心較多的α螺旋，并且與R 256～S 260一樣，處于整個鏈的末端，所以振動的幅度會相對較大.孫占莉等[22]認(rèn)為，L 44～G 50的loop區(qū)是磷酸化的結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此可以推測S 59～N 61較大的運(yùn)動幅度與PPK的磷酸化作用有關(guān).另外，漲落較小的是H 165，I 168，N 172和L 184～F 187，觀察發(fā)現(xiàn)，這些殘基均處于PPK的中心位置，與周圍殘基的作用較大，因此運(yùn)動幅度很小.尤其是L 184～F 187與DPD距離很近，推測其較低的振動幅度與DPD的結(jié)合有關(guān).

RMSF和B因子均可用于反映體系在整個模擬過程中相對于平均構(gòu)象所發(fā)生的變化，RMSF和B因子越大則對應(yīng)殘基的柔性越大.3T9I晶體結(jié)構(gòu)B因子與MD模擬結(jié)果RMSF數(shù)值的相關(guān)性分析結(jié)果如圖5所示.

圖5晶體結(jié)構(gòu)B因子與RMSF的相關(guān)性

從圖5中可知，計算得到的RMSF與B因子的實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)系數(shù)為0.35，由于樣本量較大(N=228)，因此2組數(shù)據(jù)存在顯著的相關(guān)性，也證明整體柔性分析的可靠性.

2.2分子識別

2.2.1能量分解.

PPK與DPD的識別密切相關(guān)的殘基的能量分解結(jié)果如表1所示.

表1　PPK與DPD結(jié)合密切相關(guān)殘基的能量分解結(jié)果(KJ/mol)

表1中，Evdw為真空狀態(tài)下的范德華結(jié)合能，Eele為真空靜電結(jié)合能，Egb為極性溶劑化結(jié)合能，Egbsur為非極性溶劑化結(jié)合能.從表1可知：分子內(nèi)能(即Evdw+Eele)是促進(jìn)二者結(jié)合的主要動力；PPK的G 45～V 52和L 120～V 126是有利于與抑制劑結(jié)合的主要區(qū)域.另外，I 185的能量最低，用VMD觀察可知，I 185與DPD的空間位置非常接近，因此可以推測I 185在PPK與DPD的識別過程中起重要的作用，這與前面柔性分析的結(jié)果一致.

2.2.2結(jié)合模式.

DPD的接觸殘基情況如圖6所示.接觸殘基定義為在4?范圍內(nèi)所有的氨基酸，DPD用紫色stick表示，其余殘基均用綠色stick表示.

圖6PPK與DPD的結(jié)合模式

從圖6可以看出，DPD的接觸殘基共有17個，完全包含了上面能量分解結(jié)果中的所有殘基，證明了上述能量分解的可靠性.并且上述的17個殘基組成了一個“凹"形的口袋，DPD正好能夠結(jié)合在該口袋中，也證明了這種結(jié)合模式的合理性.另外，從圖6中可以看出，距離DPD最近的氨基酸有L 120，L 44，F(xiàn) 49，I 185和L 174，均為疏水性氨基酸，因此PPK與DPD識別的主要作用力為疏水作用.

2.2.3氫鍵.

PPK與DPD之間形成的氫鍵情況如表2所示.氫鍵采用幾何判據(jù)[23]，供體與受體之間的夾角(Angle)大于135°，供體與受體之間的距離(Distance)小于0.35 nm.表2中Freq表示氫鍵占有率，即指氫鍵在整個模擬過程中出現(xiàn)的幾率.氫鍵從能量和方向性兩個角度均有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)與底物所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，有利于二者間的識別.

從表2可以看出，R 57與D 60之間可形成了多個較穩(wěn)定的氫鍵，通過觀察二者在空間中的位置得知，R 57和D 60處于兩個β折疊之間的loop區(qū)上，并且處于蛋白的最外側(cè)，因此生理學(xué)意義不大.另外，Q 127與D 131位于整個結(jié)合口袋的外側(cè)，推測二者之間的氫鍵對于維持整個口袋的入口形狀起關(guān)鍵作用.

表2　PPK-DPD復(fù)合物內(nèi)部的氫鍵

2.2.4關(guān)鍵殘基的距離.

DPD與I 185的質(zhì)心之間的距離隨模擬時間的變化圖如圖7所示.

圖7DPD與I 185之間的距離隨時間的變化

從圖7可以看出，二者之間的距離在11 ns后穩(wěn)定，為0.574±0.025 nm，漲落幅度為4%，DPD與I 185處于較穩(wěn)定的距離.表1中數(shù)據(jù)也顯示I 185在DPD與PPK識別的過程中起到重要的作用，因此推測DPD-I 185之間的范德華力是PPK與DPD識別的關(guān)鍵.

2.3分子的運(yùn)動性及構(gòu)象分析

2.3.1自由能曲面.

PPK與DPD復(fù)合物體系的自由能面圖如圖8所示，圖中顏色越深的區(qū)域，表示自由能越低.

圖8復(fù)合物的自由能曲面圖

從圖8可知，復(fù)合物體系有2個相對獨(dú)立的能量區(qū)域，分別標(biāo)記為M1和M2，這些獨(dú)立的能量區(qū)域代表模擬過程中體系最穩(wěn)定的狀態(tài).

2.3.2成簇分析.

為了更好研究圖8中體系的能量最低構(gòu)象，實(shí)驗(yàn)以2.3 nm為RMSD域值，體系的成簇分析結(jié)果如圖9所示.

圖9基于復(fù)合物體系的RMSD成簇分析

從圖9可以看出，體系成簇數(shù)為2個，5.5 ns以前為第1簇，(5.5～20) ns為第2簇，它們所占的概率分別是28.0%和72.0%.顯然，體系的構(gòu)象在5.5 ns前后有較明顯的變化，這與圖3中RMSD的漲落情況相符合.

2.3.3構(gòu)象分析.

為了更詳細(xì)了解每簇的代表性構(gòu)象，通過分析圖2的勢能結(jié)果，分別找到了2簇中的能量最低構(gòu)象.圖10給出了2個代表性構(gòu)象的疊落圖，對應(yīng)的代碼分別是4 736(綠色)和16 089(黃色).具體來說，體系構(gòu)象變化不大， 小分子DPD的構(gòu)象也沒有發(fā)生較大變化，通過觀察體系的整體構(gòu)象得知，變化較大的是末端的I 249～S 260段，該段loop處于蛋白外側(cè)，運(yùn)動幅度較大，因此造成了RMSD波動較大，而整個體系的核心區(qū)域(即結(jié)合口袋附近，I 185，D 186和L 120～R 122等殘基)的構(gòu)象很穩(wěn)定，未發(fā)生較大變化.因此，PPK核心區(qū)域較高的保守性是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵.

圖10　能量最低構(gòu)象的疊落

3結(jié)論

通過對PPK-DPD復(fù)合物進(jìn)行了20 ns的顯含水MD分子動力學(xué)模擬，基于RMSF計算值與B因子實(shí)驗(yàn)值具有顯著相關(guān)性，證明了MD模擬和柔性分析的可靠性.通過結(jié)合自由能和氫鍵的分析，給出了水溶液中PPK與DPD的結(jié)合模式圖，得到DPD結(jié)合的主要驅(qū)動力是氨基酸的疏水作用的結(jié)論，并且提出I 185與DPD之間的范德華作用力在識別過程中起重要作用.通過自由能曲面和成簇分析體系構(gòu)象變化發(fā)現(xiàn)，蛋白的核心區(qū)域并未發(fā)生較大的構(gòu)象變化，因此，核心區(qū)域的保守性是PPK發(fā)揮功能的重要機(jī)制.本研究的模擬結(jié)果為更深入理解PPK與DPD的分子識別以及DPD類抑制劑的藥物設(shè)計具有一定的指導(dǎo)意義.

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Molecular Recognition Between Pim-1 Protein Kinase and 3,5-disubstituted Pyrazolopyridine Derivatives

LIANGLi1,HUJianping1,2,DUWenyi1,ZUOKe1,LIUWei1,GOUXiaojun1

(1.Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development, Chengdu University, Chengdu 610106, China;.College of Chemistry, Leshan Normal University, Leshan 614004, China)

Abstract:Pim-1 kinase,with serine/threonine kinase activity,can lead to tumor formation if it is over expressed,so it is a potential anti-cancer drug target.In this paper,a 20 ns molecular dynamics simulation is performed on the compound of PPK and a 3,5-disubstituted pyrazolopyridine derivative.The main driving force of the compound is analyzed from the perspective of energy.Then,the key function of I 185 in recognition is analyzed independently.Finally,the paper analyzes the conformational changes of the compound in the simulation process.The results show that the conservative property of the core region of PPK is an important mechanism for its physiological function.The simulation results are helpful for the following drug design of inhibitor based on PPK.

Key words:Pim-1 protein kinase;molecular dynamics;cluster analysis;free energy surface chart;conformational changes

文章編號：1004-5422(2016)02-0107-06

收稿日期：2016-03-02.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(11247018,11147175)、 四川省教育廳科研重點(diǎn)課題(12ZA066)資助項(xiàng)目.

作者簡介：梁立(1983 — )， 女， 碩士， 助理研究員， 從事生物信息學(xué)研究.

中圖分類號：R914.5；R96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A