李燕梅包廣潔，2鐘妮呂瑋張文霞王蘭蘭康宏

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000

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山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤膠原構(gòu)筑和生物力學(xué)性能研究

李燕梅1包廣潔1，2鐘妮1呂瑋1張文霞1王蘭蘭3康宏1

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000

［摘要］目的 為工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤組織建立客觀的生物力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。方法 從4只健康1月齡山羊頭中完整分離8個(gè)顳下頜關(guān)節(jié)盤，用直徑3 mm的沖子在前、中、后帶取圓柱狀試樣，預(yù)處理壓縮速度為0.025 mm·s-1，結(jié)束條件為最大載荷小于4.9 N，壓縮位移1.5 mm，循環(huán)3次，在預(yù)處理基礎(chǔ)上完成壓縮實(shí)驗(yàn)，獲取各區(qū)帶的應(yīng)力應(yīng)變關(guān)系圖和彈性模量值。掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡觀察各區(qū)帶的超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維走向。結(jié)果 1）關(guān)節(jié)盤組織的生理應(yīng)變范圍在10%以內(nèi)，關(guān)節(jié)盤組織的擬線性本構(gòu)方程可以用多項(xiàng)式y(tǒng)=ax+bx2+cx3進(jìn)行擬合。2）關(guān)節(jié)盤中間帶的彈性模量值最大，其與前帶和后帶均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），前帶與后帶之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.361）。3）顳下頜關(guān)節(jié)盤內(nèi)部呈現(xiàn)環(huán)形膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，中間帶膠原排列致密，呈前后向排列；前帶和后帶主要呈內(nèi)外走向，伴有前后方向的纖維。結(jié)論 環(huán)形膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤抗力性能的基礎(chǔ)，中間帶抗壓性能高于前帶和后帶。

［關(guān)鍵詞］顳下頜關(guān)節(jié)盤； 擬線性本構(gòu)方程； 壓縮實(shí)驗(yàn)； 彈性模量； 掃描電子顯微鏡； 偏振光顯微鏡

顳下頜關(guān)節(jié)盤（temporomandibular joint disc，TMD）是下頜髁突和顴骨關(guān)節(jié)窩之間的纖維軟骨樣組織，主要由成纖維樣細(xì)胞和軟骨樣細(xì)胞構(gòu)成。國外研究［1］報(bào)道，50%～75%的人至少有過單側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)疼痛的經(jīng)歷，其中33%的人至少有一次持續(xù)性關(guān)節(jié)疼痛癥狀。我國顳下頜關(guān)節(jié)盤的既往功能紊亂患病率為18.3%，但臨床檢查功能紊亂患病率為54.2%，女性高于男性［2-3］。學(xué)者［4-5］認(rèn)為顳下頜關(guān)節(jié)病可能是由精神因素、因素、其他因素（如行為習(xí)慣、創(chuàng)傷、自然環(huán)境、代謝、免疫、關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)育異常等）綜合導(dǎo)致，其中大約70%的關(guān)節(jié)疾病與關(guān)節(jié)盤的病變有關(guān)，多以關(guān)節(jié)盤變薄、透明樣變、穿孔為主要特征。正常情況下，顳下頜關(guān)節(jié)盤具有良好的抗壓特性，但在受到不正常的壓力或穿孔后，一般不能自我修復(fù)。近年來，組織工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤的研究為臨床治療關(guān)節(jié)盤疾病提供了一條新途徑，但是這一領(lǐng)域的研究存在的主要問題有：沒有理想的細(xì)胞源和合適的動(dòng)物模型、支架的生物學(xué)功能匹配性差、工程化組織的強(qiáng)度和功能與正常組織有較大差異等，制約了這項(xiàng)工作的開展［6］。

研究［7-8］表明，山羊的顳下頜關(guān)節(jié)盤在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面較其他動(dòng)物更接近于人。筆者在前期的實(shí)驗(yàn)中對山羊關(guān)節(jié)盤的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及免疫組織化學(xué)進(jìn)行了初步分析［9］，證明用山羊作為組織工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤研究的動(dòng)物模型是可行的［10］。對山羊關(guān)節(jié)盤的生物力學(xué)性能進(jìn)行表征，將為工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤組織建立客觀的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為功能性組織工程的深入研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Instron 5960系列雙立柱臺(tái)式微力試驗(yàn)機(jī)（Instron公司，美國），是一款電子萬能微力試驗(yàn)機(jī)，可用于各種組織原材料、復(fù)合材料、塑料、橡膠材料和金屬等的壓縮、拉伸以及剪切力學(xué)性能的測試，與Bluehill 3軟件配套使用。

1.2 標(biāo)本收集

從當(dāng)?shù)赝涝讏鲑徺I新鮮屠宰的健康1月齡山羊頭4個(gè)，清洗干凈后在75%乙醇中浸泡半小時(shí)，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)完整切取雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤，將周圍關(guān)節(jié)囊組織修剪干凈后，用生理鹽水徹底沖洗備用。

1.3 生物力學(xué)測試

1.3.1 試樣制備 根據(jù)文獻(xiàn)［11］中關(guān)節(jié)盤的五分區(qū)方法，將關(guān)節(jié)盤分為前、中、后、內(nèi)、外帶，每個(gè)區(qū)帶大小均為關(guān)節(jié)盤的五分之一，并在前、中、后帶中央按冠狀方向用取樣工具沖子（直徑3 mm）制作圓柱狀壓縮試樣，每帶取4個(gè)試樣放入4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)前將試樣從4 ℃冰箱中取出，用數(shù)顯卡尺測出每個(gè)試樣的厚度值，在微力試驗(yàn)機(jī)上輸入基本參數(shù)（樣品厚度和直徑）。打開Bluehill 3軟件，設(shè)置預(yù)處理壓縮速度為0.025 mm·s-1，結(jié)束條件為最大載荷小于4.9 N，壓縮位移小于1.5 mm［11-12］。壓縮過程中，將試樣置于一次性培養(yǎng)皿中，并滴注少量PBS液保持試樣濕潤，手動(dòng)調(diào)節(jié)壓頭，壓頭與試樣無限接近時(shí)，開始預(yù)壓縮處理，循環(huán)3次即可。

1.3.3 壓縮實(shí)驗(yàn) 在預(yù)處理的基礎(chǔ)上設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)載荷從零緩慢增加至其最大值（小于4.9 N，傳感器精度為5 N），利用Bluehill 3軟件計(jì)算出試樣的彈性模量值、壓縮應(yīng)變在10%和20%時(shí)的壓縮應(yīng)力、載荷、時(shí)間、位移等參數(shù)［12-14］，獲取各區(qū)帶的應(yīng)力應(yīng)變的關(guān)系圖。

1.4 掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡觀察

關(guān)節(jié)盤組織按不同分區(qū)制備成約2 mm大小的樣品，每個(gè)分區(qū)各4個(gè)樣品。在4%戊二醛中浸泡24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，冷凍干燥機(jī)中干燥8 h，真空噴金，在掃描電子顯微鏡（S-3400N型，Hitachi公司，日本）下觀察關(guān)節(jié)盤不同分區(qū)的表面和斷面超微結(jié)構(gòu)。根據(jù)試樣分區(qū)，利用冰凍切片機(jī)（CM1100型，LEICA公司，德國）將關(guān)節(jié)盤試樣按水平面和冠狀面切成20 μm厚的切片，在偏振光顯微鏡（BX51型，Olympus公司，日本）下觀察關(guān)節(jié)盤內(nèi)部不同區(qū)帶的膠原纖維走向。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析（ANOVA）和LSD-t檢驗(yàn)比較關(guān)節(jié)盤前、中、后帶的彈性模量的差異，選取α值為0.05。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)盤不同區(qū)間壓縮應(yīng)力與應(yīng)變的關(guān)系

從關(guān)節(jié)盤前、中、后帶的應(yīng)力應(yīng)變曲線圖（圖1）可見，各帶的曲線圖走形基本一致，坡腳區(qū)（toeregion）出現(xiàn)在壓縮應(yīng)變的10%以內(nèi)，即關(guān)節(jié)盤組織的生理應(yīng)變范圍在10%以內(nèi)。壓縮應(yīng)變達(dá)到10%以后，曲線變陡直，應(yīng)力隨應(yīng)變明顯增加。各區(qū)帶的坡腳區(qū)略有不同，中間帶的坡腳區(qū)相對較小。

2.2 關(guān)節(jié)盤不同區(qū)間壓縮應(yīng)力與應(yīng)變的理論分析

根據(jù)擬線性黏彈性理論，關(guān)節(jié)盤各區(qū)帶的應(yīng)力應(yīng)變值可以用多項(xiàng)式y(tǒng)=ax+bx2+cx3作為擬線性本構(gòu)方程，得到擬合后的實(shí)驗(yàn)曲線。此本構(gòu)方程可以為顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程提供原始力學(xué)性能參考。

圖 1 關(guān)節(jié)盤各帶的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖Fig 1 Stress-strain curve of articular disc of each band

2.3 關(guān)節(jié)盤不同區(qū)間彈性模量的比較

山羊關(guān)節(jié)盤前、中、后帶的彈性模量分別為（2.21±0.14）、（2.47±0.11）、（2.25±0.19） MPa。統(tǒng)計(jì)分析表明，關(guān)節(jié)盤中間帶的彈性模量值最大，其與前帶和后帶均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.002，P= 0.018），前帶與后帶間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.361）。

2.4 掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡分析

關(guān)節(jié)盤各帶的掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡分析見圖2和圖3。

圖 2 關(guān)節(jié)盤各帶的表面和切面 掃描電子顯微鏡 × 1 000Fig 2 Articular disc surface and cut surface of each band scanning electron microscope × 1 000

圖 3 關(guān)節(jié)盤各帶的表面和切面 偏振光顯微鏡 × 200Fig 3 Articular disc surface and cut surface of each band polarized light microscope × 200

掃描電子顯微鏡（圖2）可見，關(guān)節(jié)盤表面均勻覆蓋著凝膠樣物質(zhì)，纖維粗細(xì)從幾微米到幾十微米不等。水平面掃描顯示，前帶和后帶的纖維大致平行排列呈波紋或溝紋狀結(jié)構(gòu)，而中間帶的膠原纖維束則排列致密，呈條索狀，關(guān)節(jié)盤內(nèi)外側(cè)的膠原纖維束呈網(wǎng)紋狀排列，外側(cè)較內(nèi)側(cè)粗。切面掃描顯示，前、后、內(nèi)、外帶纖維方向不完全單一而呈現(xiàn)參差不齊的纖維斷面，中間帶則呈現(xiàn)出魚鱗狀的纖維束斷面。偏振光顯微鏡圖（圖3）可見，在山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤內(nèi)部，其周圍區(qū)域纖維呈環(huán)形包繞而在中間帶區(qū)域呈前后向排列，前帶和后帶區(qū)域的纖維主要呈內(nèi)外走向并伴有前后方向的分支纖維，內(nèi)側(cè)和外側(cè)的纖維以前后走向?yàn)橹?，夾雜有上下和內(nèi)外向的分支纖維。綜合分析，顳下頜關(guān)節(jié)盤內(nèi)部呈現(xiàn)環(huán)形膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

3 討論

彈性模量是表征在彈性限度內(nèi)物質(zhì)材料抗壓或抗拉的物理量，其大小標(biāo)志了材料的剛性，模量越大，越不容易發(fā)生形變［15］。本實(shí)驗(yàn)顯示，山羊關(guān)節(jié)盤中間帶的彈性模量大于前帶和后帶，說明中間帶的剛性最大，抵抗壓縮或外界沖擊力的性能也最好。掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡觀察顯示，中間帶以致密的前后向膠原纖維為主，與其他區(qū)域的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有所不同。

根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨二相理論，顳下頜關(guān)節(jié)盤是由黏彈性固體基質(zhì)（膠原和蛋白多糖）和自由流動(dòng)的間隙液組成的二相混合物，在生物力學(xué)性能方面具有彈性和黏彈性。本研究結(jié)果表明，關(guān)節(jié)盤在承受較小的應(yīng)力應(yīng)變范圍（10%）內(nèi)，發(fā)生的彈性形變可以恢復(fù)到原來的狀態(tài)，這一區(qū)域即為組織的生理應(yīng)變區(qū)，在應(yīng)力應(yīng)變圖上顯示為坡腳區(qū)。但當(dāng)超過應(yīng)變的10%，組織的剛性隨著應(yīng)變的變化迅速增加，反映了組織通過對剛度的調(diào)節(jié)來適應(yīng)外界條件的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合擬線性黏彈性理論，采用多項(xiàng)式對不同區(qū)帶的應(yīng)力應(yīng)變曲線進(jìn)行理論擬合，獲得了多項(xiàng)式方程y=ax+bx2+cx3，這為今后組織工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤的研究提供了方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)按不同分區(qū)取樣進(jìn)行了掃描電子顯微鏡和偏振光顯微鏡的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤中間帶纖維呈前后走向的致密板層狀結(jié)構(gòu)，前帶和后帶的纖維一般為內(nèi)外向并穿插有前后向和上下向的細(xì)小纖維束。組織的抗壓縮性能與其內(nèi)的組織液含量有很大關(guān)系，山羊關(guān)節(jié)盤中間帶的板層樣結(jié)構(gòu)對外界的沖擊壓力有一定的對抗和緩沖作用，這與其他學(xué)者［16］對豬顳下頜關(guān)節(jié)盤內(nèi)的生物力學(xué)功能的研究結(jié)果接近。此外，關(guān)節(jié)盤的抗壓縮性能除了與其內(nèi)的液體含量、膠原纖維分布和走向有關(guān)外，可能還與關(guān)節(jié)盤不同區(qū)帶間富含的蛋白多糖和糖胺多糖的含量有關(guān)。對豬關(guān)節(jié)盤不同區(qū)帶的定量生化研究顯示，中間帶含有最多的膠原蛋白和糖胺多糖［16］，這可能也是關(guān)節(jié)盤中間帶彈性模量高的原因之一。

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（本文編輯 李彩）

［中圖分類號(hào)］R 322.4+1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.015

［收稿日期］2015-07-24； ［修回日期］ 2015-10-27

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金（81160139）

［作者簡介］李燕梅，碩士，E-mail：ymli13@lzu.edu.cn

［通信作者］康宏，教授，博士，E-mail：Kanghong@lzu.edu.cn

Collagen structure and biomechanical properties of the goat temporomandibular joint disc

Li Yanmei1， Bao Guangjie1，2，Zhong Ni1， Lü Wei1， Zhang Wenxia1， Wang Lanlan3， Kang Hong1.
（1. Institute of Stomatology， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 2. Key Lab of Stomatology of State Ethnic Affairs Commission， Northwest University for Nationalities， Lanzhou 730030， China； 3. School of Life Science， Lanzhou University， Lanzhou730000， China）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China （81160139）. Correspondence: Kang Hong， E-mail: Kanghong@lzu.edu.cn.

［Abstract］Objective To establish objectively biomechanical criteria for temporomandibular joint disc tissue engineerings. Methods Eight temporomandibular joint discs from a four-month-old goat were separated completely. A cylindrical sample with diameter of 3 mm in the anterior， intermediate， and posterior bands was obtained， and the samples underwent pre-compression test with three cycles under a speed of 0.025 mm·s-1. With the end condition for the maximum load of less than 4.9 N and 1.5 mm compression displacement， the formal compression test was performed with the same speed. Moreover， this test obtained the stress-strain relationship and elastic modulus of each disc band. Ultrastructure and collagen fiber orientation of the district zone were observed by scanning electron microscope and polarized light microscope. Results 1） The physiological strain range of an articular disc was within 10%， and the quasilinear constitutive equation of articular disc tissues can be fitted with the polynomial function: y=ax+bx2+cx3. 2） The elastic modulus of the intermediate disc zone was the largest （P＜0.05）. No significant difference existed between the anterior and posterior bands （P=0.361）. 3） Scanning electron microscope and polarized light microscope showed an annular disc collagen network structure， which was the internal part of the goat temporomandibular joint disc. The collagen arrangement of intermediate bands was tensely arranged anterior-posteriorly. The collagen of anterior and posterior bands went through mediolaterally with intersection of anterior-posterior branch fibersd. Conclusion Annular collagen network structure is the basis for goat temporomandibular joint disc compression resistance properties. The intermediate band demonstrated higher compression resistance performance than the anterior and posterior bands.

［Key words］temporomandibular joint disc； quasi linear constitution equation； compressive testing； elastic modulus； scanning electron microscope； polarized light microscope